黃克靜 黃婷 胡文兵 向麗娜

·實(shí)驗(yàn)研究·

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

黃克靜 黃婷 胡文兵 向麗娜

目的 觀察自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)對(duì)缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)所致的急性腎損傷的保護(hù)及修復(fù)作用。方法 將成年雄性SD大鼠24只隨機(jī)分為3組：對(duì)照組，模型組，治療組，每組8只。大鼠在IR建模前14 d，取其大網(wǎng)膜周?chē)闹窘M織制備自體ADMSCs，并在建模前1 d測(cè)定大鼠的血肌酐、尿量及尿白蛋白/肌酐比值作為對(duì)照。模型組和治療組制備缺血再灌注腎損傷模型，對(duì)照組只打開(kāi)腹腔。建模1 h后，將自體ADMSCs經(jīng)大鼠尾靜脈移植到治療組，對(duì)照組和模型組給予同等體積的生理鹽水。細(xì)胞移植24 h、72 h后取大鼠血清和尿液檢測(cè)血肌酐、尿量及尿白蛋白/肌酐比值；在72 h后取腎臟組織通過(guò)HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)觀察；免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)腎臟組織內(nèi)血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)及磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶1(NAPDH quinineoxidoreductase-1，NQO-1)的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果 治療組血清肌酐水平和尿白蛋白/肌酐比值較模型組明顯減輕(P<0.05)；病理組織學(xué)觀察顯示，模型組大鼠腎臟腎小管存在形態(tài)學(xué)損傷，而治療組大鼠腎臟病理?yè)p傷明顯輕于模型組；Western blot分析顯示治療組抗氧化標(biāo)志物NQO-1和HO-1的蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組(P<0.05)。結(jié)論 ADMSCs經(jīng)大鼠尾靜脈移植后，對(duì)IR所致的腎損傷具有明顯的修復(fù)作用，其修復(fù)腎臟損傷機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

腎缺血再灌注損傷；脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；大鼠；血紅素氧化酶1

腎缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷在臨床上常見(jiàn)于急診休克復(fù)蘇、腎臟手術(shù)及腎臟移植等過(guò)程中，是影響腎功能的一個(gè)重要因素[1-3]。IR損傷的表現(xiàn)包括急性腎小管上皮細(xì)胞損傷，腎小管外周微血管的損傷以及炎癥反應(yīng)和白細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療缺血相關(guān)的器官功能障礙是有效的[4-6]，但是MSCs改善腎功能的確切機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)移植對(duì)大鼠IR的保護(hù)作用，為臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.動(dòng)物模型 雄性SD大鼠共24只，體質(zhì)量275～300 g，在分離ADMSCs前隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、模型組、治療組，每組8只。

2.主要試劑 L-DMEM、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，EDTA-Trypsin及流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記的所有抗體購(gòu)自Sigma公司。

二、方法

1.ADMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 在誘導(dǎo)IR損傷前14 d，將3組大鼠進(jìn)行吸入異氟烷麻醉，小心切除大網(wǎng)膜周?chē)窘M織0.5 g。隨后將該組織切成小于1 mm3的碎塊，按3∶1(生理鹽水∶脂肪組織)的比例往勻漿脂肪組織中加入37 ℃無(wú)菌生理鹽水，接著加入備用的膠原酶溶液至終濃度為0.5 U/ml。將含該反應(yīng)體系的離心管放置37 ℃水浴箱60 min，期間取出振動(dòng)4次。消化后，常溫下離心5 min，棄上清，生理鹽水洗2次，將所有的細(xì)胞放入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，每只大鼠可以獲得大約3×106ADMSCs。培養(yǎng)的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行分析鑒定。

2.制模及注射ADMSCs 術(shù)前12 h對(duì)大鼠禁食，水合氯醛(35 mg/kg)麻醉，異氟烷吸入麻醉并用，取腹部正中切口，逐層分離皮膚、皮下組織、腹膜，然后進(jìn)入腹腔，找到腎蒂，用無(wú)創(chuàng)性動(dòng)脈夾迅速夾閉雙側(cè)腎蒂，1 h后去掉動(dòng)脈夾，讓血流恢復(fù)灌注。對(duì)照組只進(jìn)行剖腹。恢復(fù)灌注1 h后，模型組大鼠尾靜脈注射35 μl低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，治療組大鼠注射同等體積的ADMSCs(1.0×106)。建模后72 h將動(dòng)物處死，收集腎臟用于后續(xù)研究。

3.腎功能測(cè)定 測(cè)定誘導(dǎo)IR之前及誘導(dǎo)IR后24 h、72 h 各組大鼠的血肌酐、尿白蛋白和尿肌酐水平。

4.HE染色和病理組織學(xué)評(píng)分 所有大鼠的腎臟標(biāo)本固定在10%福爾馬林緩沖液中，石蠟包埋，切片5 mm厚，HE染色。組織學(xué)檢查采用盲法，對(duì)腎小管壞死的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。隨機(jī)選擇10個(gè)視野，根據(jù)腎小管壞死、刷狀緣減少、管型形成和腎小管擴(kuò)張的程度評(píng)定分為以下等級(jí)：0(無(wú))，1分(≤10%)，2分(11%～25%)，3分(26%～45%)，4分(46%～75%)，5分(>76%)。

5.Western Blot分析 取等量的腎臟蛋白提取物(100 μg)上樣，10%SDS-PAGE分離。電泳后，分離的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯(PVDF)膜上。把膜放置在封閉液(含5%脫脂牛奶和0.05% Tween 20的T-TBS)中孵育1 h，室溫下膜和一抗(1∶1 000)孵育1 h，在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000)室溫下和膜孵育1 h，洗滌3次，ECL反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較，方差齊者用一維方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、誘導(dǎo)IR后血肌酐、尿量和尿白蛋白/肌酐比值的變化

選擇IR建模后24 h、72 h測(cè)定血肌酐的變化，模型組(棕色柱狀圖)肌酐顯著高于對(duì)照組(藍(lán)色柱狀圖)和治療組(黃色柱狀圖)，治療組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。這些結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中成功誘導(dǎo)IR損傷，ADMSCs移植在IR急性期顯著緩解IR引起的腎功能惡化。誘導(dǎo)IR后24 h，3組每日尿量沒(méi)有差異，但誘導(dǎo)IR后72 h，治療組的尿量與模型組相比顯著增加。相反，在誘導(dǎo)IR后24 h和72 h，治療組尿白蛋白/肌酐的比值低于模型組(P<0.05)。(圖1)

二、腎組織病理學(xué)評(píng)分

IR所致腎損傷在組織學(xué)上表現(xiàn)為廣泛的腎小管壞死和擴(kuò)張以及管型形成和刷狀緣減少(圖 2)。

IR后72 h治療組的腎損傷較模型組明顯減輕(P<0.05)，表明ADMSCs治療能顯著改善IR誘導(dǎo)的腎臟損傷。

對(duì)照組、模型組、治療組腎臟局部HE染色(200×in A，B&C；400×in D，E&F)結(jié)果顯示，與其他組比較，模型組呈現(xiàn)高程度的腎小管刷狀緣減少，管型形成，腎小管擴(kuò)張。

三、IR損傷后腎實(shí)質(zhì)中抗氧化物質(zhì)蛋白質(zhì)表達(dá)

血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是抗氧化標(biāo)志物，在IR損傷后72 h，治療組腎組織HO-1蛋白表達(dá)明顯高于模型組(圖3A)。磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶1(NAPDHquinineoxidoreductase-1，NQO-1)是另一種抗氧化標(biāo)志物，在IR損傷后72 h，治療組腎組織NQO1蛋白表達(dá)高于模型組(圖3B)。

注：圖A：誘導(dǎo)IR后24h、72h，治療組血肌酐水平較模型組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(aP<0．05)。圖B：誘導(dǎo)IR后24h，模型組、治療組尿量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)；誘導(dǎo)IR后72h，治療組尿量與模型組比較明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(bP<0．05)。圖C：誘導(dǎo)IR后24h、72h，模型組與治療組尿白蛋白/肌酐比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(cP<0．05)。圖1 誘導(dǎo)IR后24h、72h，3組血肌酐、尿量和尿白蛋白/肌酐比值的變化

注：對(duì)照組、模型組、治療組腎臟局部HE染色(200×inA，B&C；400×inD，E&F)；與其他組比較，未模型組呈現(xiàn)高程度的腎小管刷狀緣減少、管型形成、腎小管擴(kuò)張圖2 IR后72h各組大鼠腎臟局部結(jié)構(gòu)

注：1為對(duì)照組，2為模型組，3為治療組圖3 抗氧化標(biāo)志物的蛋白表達(dá)

討 論

IR損傷有關(guān)的患者病死率一直居高不下，臨床上也缺乏有效的治療手段。一旦腎小管損壞嚴(yán)重而不能完全恢復(fù)，就可能進(jìn)入慢性腎衰竭階段，需長(zhǎng)期或終身行腎臟替代治療或腎移植。IR損傷的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，是炎性細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞因子等多方面相互影響作用的結(jié)果。近年來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞治療IR損傷成為研究熱點(diǎn)，已有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞可以改善腎臟缺血再灌注所致的腎損傷[7-8]。在缺血再灌注模型的研究中發(fā)現(xiàn)MSCs可通過(guò)旁分泌抗凋亡因子、促有絲分裂因子及血管生成因子等在調(diào)節(jié)免疫、參與血管重建、修復(fù)腎臟損傷微環(huán)境等方面有重要作用。在最近對(duì)不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，ADMSCs具有更多的臨床應(yīng)用潛能，它可來(lái)源于自體，容易在體外大量擴(kuò)增，可遷移到受損部位，產(chǎn)生大量抗炎癥細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，并且擁有免疫調(diào)節(jié)特性，這些賦予了它比其他類型干細(xì)胞更大的潛能和優(yōu)勢(shì)[9-11]，且ADMSCs相比較于臍帶或臍血來(lái)源的干細(xì)胞更容易實(shí)現(xiàn)自體移植，故本研究為ADMSCs治療IR損傷提供了一定的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上為了驗(yàn)證ADMSCs對(duì)腎臟IR損傷的治療修復(fù)作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了對(duì)照組；模型組為單純的IR組，觀察建模是否成功；治療組驗(yàn)證ADMSCs對(duì)IR所致的腎損傷的修復(fù)作用。本研究結(jié)果顯示，IR建模后，血清肌酐及尿蛋白/肌酐比值開(kāi)始升高，24 h達(dá)到高峰后開(kāi)始降低，ADMSCs組在72 h后已接近正常組數(shù)值，這都說(shuō)明ADMSCs能顯著降低大鼠IR的腎損傷，并且從腎臟組織病理切片染色也能觀察到ADMSCs注射能顯著降低腎損傷，表明其對(duì)大鼠IR損傷的治療作用。

在對(duì)腎損傷的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是諸多腎臟疾病模型的發(fā)病機(jī)制，而核轉(zhuǎn)錄因子紅細(xì)胞系-2p45(NF-E2)相關(guān)因子-2(nuclear factor erythroid-2p45-related factor，Nrf2)和抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)是研究機(jī)制中最重要的信號(hào)通路之一。Nrf2-ARE信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控下游靶基因和重要解毒酶靶基因的轉(zhuǎn)錄從而起到保護(hù)作用，其中HO-1和NQO-1是Nrf2-ARE信號(hào)通路中重要的下游靶基因[12]：HO-1可催化形成膽綠素、膽紅素、鐵離子。膽綠素和膽紅素是體內(nèi)強(qiáng)有力的自由基清除劑，具有廣譜抗氧化能力，而鐵蛋白是細(xì)胞內(nèi)抗氧化損傷能力的保護(hù)劑[13]；NQO-1借助煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作為電子供體，催化醌類物質(zhì)發(fā)生還原反應(yīng)，降解醌類及其衍生物，阻止其進(jìn)一步參與氧化還原反應(yīng)和活性氧的產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[14]。Wu等[15]的研究表明在腎臟缺血再灌注的條件下，與Nrf2基因敲除小鼠相比，野生型小鼠促進(jìn)Nrf2下游基因包括HO-1及NQO-1的表達(dá)從而達(dá)到抗細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)野生型小鼠的肌酐和尿素氮等反映腎損傷的指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)，并且用Nrf2的小分子誘導(dǎo)劑(抗氧化劑谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸)預(yù)處理野生型和Nrf2基因敲除小鼠，只有野生型小鼠的腎損傷得到改善。這表明Nrf2在IR所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激造成的腎損傷有顯著的保護(hù)作用[16]。

本研究顯示IR建模72 h后，治療組的HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組及IR組，有趣的是其與腎損傷生物學(xué)指標(biāo)(血肌酐及其與蛋白的比值)和組織學(xué)結(jié)果一致，提示為應(yīng)對(duì)IR損傷后一系列腎臟損傷過(guò)程，ADMSCs的注射通過(guò)誘導(dǎo)HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)增多來(lái)增強(qiáng)了大鼠的抗氧化能力及抗損傷能力，與Wu 等[15]所報(bào)道的結(jié)果一致。

綜上所述，ADMSCs的移植可以治療急性IR所導(dǎo)致的腎損傷，其通過(guò)抗氧化應(yīng)激保護(hù)腎功能，促進(jìn)損傷腎組織細(xì)胞再生，在腎衰竭及其他腎臟疾患的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞修復(fù)中意義重大。

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Protective effect of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells on renal ischemia reperfusion injury

HUANGKe-jing,HUANGTing,HUWen-bing,XIANGLi-na.

TheKeyLaboratoryofKidneyDiseasesPreventionandInterventionofHubeiProvince,HuangshiCentralHospital,EdongHealthcareGroup,Huangshi435000,China

Corresponding:HUWen-bing,E-mail:huwenbing75@sina.com

Objective To observe the protective effects of tail veil injection of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells(ADMSCs) on the renal ischemia reperfusion(IR) injury of rats.Methods Adult male Sprague-Dawley (SD) rats(n=24) were equally randomized into sham operation group(sham control), IR injury model group(IR plus saline only), and cell therapy group(IR plus intravenous administration of 1.0×106autologous ADMSCs),n=8 each group. Fourteen days before IR, the adipose tissue around the greater omentum was cut for the preparation of ADMSCs. Twenty-four h before modeling, serum creatinine, urine volume and urinary albumin/creatinine ratio were evaluated as blank controls. The renal IR injury model was set up. In the sham group, the middle incision was cut and sutured. One h after IR, ADMSCs were transplanted through tail vein of rats in cell therapy group, and the same volume of normal saline was injected into the rats of sham operation group and model group. The renal functional indexes including serum creatinine, urine volume and urinary albumin/creatinine ratio were detected by biochemical method 24 h and 72 h after IR. The pathological changes were observed by HE staining, and the relative expression of HO-1 and NQO-1 was detected by Western blotting.Results The results of biochemical detection(serum creatinine and urinary albumin/creatinine ratio) showed that the kidney function of rats in cell therapy group was significantly better than in model group(P<0.05). The histopathological observation showed that the obvious morphological damage was observed in the renal tubule in model group, and amelioration was observed in cell therapy group. Western blotting showed notably higher expression of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1(NQO1) and HO-1 proteins, two indicators of anti-oxidative capacity, in cell therapy group than in model group.Conclusions ADMSCs therapy minimized kidney damage after IR injury through suppressing oxidative stress.

Kidney ischemia reperfusion injury；Adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs; Rat; Heme oxygenase-1

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.02.010

湖北省自然科學(xué)基金(No.2015CFB473)；黃石市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015B046-4)；腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)基金項(xiàng)目(No.SB201601)

435000 湖北省黃石市中心醫(yī)院腎臟內(nèi)科(黃克靜，黃婷，向麗娜)；腫瘤內(nèi)科(胡文兵)

胡文兵，E-mail：huwenbing75@sina.com

2016-12-09

2017-02-03)