楊祎程，張國權(quán)，張元來，劉立軍，張 亮，田啟會，張進隆

（1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，武威 733006；2.甘肅省武威市畜牧獸醫(yī)局，武威 733000）

曲子宮絳蟲染色標(biāo)本的制作和生殖器官觀察

楊祎程1，張國權(quán)1，張元來2，劉立軍1，張 亮1，田啟會1，張進隆1

（1.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，武威 733006；2.甘肅省武威市畜牧獸醫(yī)局，武威 733000）

為了研究曲子宮絳蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生殖器官的變化規(guī)律，用H.E染色法制作曲子宮絳蟲的染色標(biāo)本，對傳統(tǒng)的染色方法進行了改進，制作出結(jié)構(gòu)清晰、顏色鮮艷的曲子宮絳蟲標(biāo)本，在光學(xué)顯微鏡下觀察到該絳蟲成節(jié)中雌雄生殖系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)以及孕節(jié)中的子宮和蟲卵結(jié)構(gòu)。該研究可為該曲子宮絳蟲形態(tài)學(xué)蟲種鑒定和生殖器官變化規(guī)律增添新資料，為本病的確診提供參考依據(jù)。

曲子宮絳蟲；生殖器官；蘇木素染色

曲子宮絳蟲隸屬于扁形動物門絳蟲綱，多節(jié)絳蟲亞綱，圓葉目，裸頭科，該屬絳蟲為大型絳蟲，體長可達4.3m，常寄生于綿羊、山羊、黃牛、牦牛等反芻動物的小腸中。一條完整的絳蟲由頭節(jié)、頸節(jié)和體節(jié)3部分組成，生殖系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)是曲子宮絳蟲比較重要的結(jié)構(gòu)［1］。關(guān)于莫尼茨絳蟲的形態(tài)學(xué)研究和染色方法報道很多，但對曲子宮絳蟲形態(tài)學(xué)的研究和染色方法的研究報道很少。本實驗以甘肅省天祝地區(qū)高山細毛羊小腸中采集到的曲子宮絳蟲為材料，采用H.E染色法制作曲子宮絳蟲的染色標(biāo)本，對傳統(tǒng)的染色方法做了改進，制作了結(jié)構(gòu)清晰、顏色鮮亮、不易褪色的曲子宮絳蟲的染色標(biāo)本。在光學(xué)顯微鏡下觀察到該絳蟲幼節(jié)中可見排泄系統(tǒng)和萌芽狀態(tài)的生殖系統(tǒng)；成節(jié)中發(fā)育完成的雌雄生殖系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)；孕節(jié)中子宮和蟲卵的結(jié)構(gòu)。該研究可為該蟲體在形態(tài)學(xué)蟲種鑒定和生殖器官變化規(guī)律增添新資料，為本病的確診提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲種

實驗用曲子宮絳蟲采自甘肅省天祝縣牛羊定點屠宰場1歲齡高山細毛羊的小腸中。

1.2 試劑和儀器

蘇木素精，酒精，銨明礬，甘油，甲醇，二甲苯，加拿大樹膠，載玻片，蓋玻片，Olympus光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)，等等。

1.3 方法

1.3.1 蟲體的處理 將采集的綿羊絳蟲先用自來水沖洗3次，再用生理鹽水漂洗浸泡，后將完整的蟲體從頭節(jié)開始剪成2 cm左右的小段，依次按1-1、1-2、1-3…的編號方法編號，將樣品分別用70%乙醇固定，用于制片。

1.3.2 絳蟲染色標(biāo)本制作 將選取的絳蟲節(jié)段壓入兩潔凈的載玻片中間，為了不使蟲體壓得過薄，可在載玻片兩端墊以適當(dāng)厚度的紙片，用線繩扎緊載玻片兩端，投入70%酒精中固定24～48 h，然后用蘇木素-伊紅（H.E染色法）染色法染色。具體步驟：①酒精洗脫：將壓片固定好的蟲體投入梯度酒精中，50%酒精，10 min→30%酒精，10 min→蒸餾水，10 min；②染色：蘇木素染色液30 min→用蒸餾水漂洗10min；③分色：用1%鹽酸溶液分化10～20 s；④染色：水伊紅染液10 min；⑤脫水：80%酒精，5 min→90%酒精，10min→95%酒精，10min，100%酒精Ⅰ，10min→100%酒精Ⅱ，10 min；⑥透明：苯酒精（1∶1），10 min→二甲苯，10 min；⑦封固：加拿大樹膠封固。

1.3.3 實驗用絳蟲染色標(biāo)本的制作 將1.3.2中得到的染色標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)其形態(tài)特征，確定所采得的絳蟲的種類，確定曲子宮絳蟲對應(yīng)的編號，將所有曲子宮絳蟲從頭節(jié)至孕節(jié)的樣品用H.E染色法制作染色標(biāo)本。

2 結(jié)果

2.1 曲子宮絳蟲寄生部位

曲子宮絳蟲寄生于高山細毛羊空腸前段的小腸黏膜上（見圖1-1）。

2.2 外部形態(tài)的觀察

曲子宮絳蟲成蟲蟲體呈背腹扁平的帶狀，乳白色，蟲體長2.7 m，幼節(jié)寬0.3～0.8 mm，成節(jié)寬4.0～10.0 mm，孕節(jié)寬8.0～15.0 mm。頭節(jié)小，呈圓球形；頸節(jié)在頭節(jié)之后，比頭節(jié)細而薄，幼節(jié)細而薄，成節(jié)比幼節(jié)寬，也較厚，孕節(jié)寬而厚，每個節(jié)片呈上窄下寬的梯形。

2.3 染色標(biāo)本形態(tài)觀察

用H.E染色法染制的標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下觀察，曲子宮絳蟲成蟲頭節(jié)呈紫紅色，4個近圓形吸盤位于頭節(jié)前端的側(cè)面，均勻排列；頸節(jié)呈紫紅色，分節(jié)很細，排泄管清晰可見，看不到生殖系統(tǒng)器官（圖1-2）；幼節(jié)呈紫紅色，排泄管清晰可見，生殖系統(tǒng)可見萌芽狀態(tài)卵巢、卵模、卵黃腺、睪丸等生殖器官均未發(fā)育成熟（圖1-3，圖1-4）；成節(jié)內(nèi)有一組生殖器官，無規(guī)律地分布于節(jié)片一側(cè)，生殖孔開口于生殖器官分布的一側(cè)，卵巢和卵黃腺在節(jié)片一側(cè)構(gòu)成菜花狀結(jié)構(gòu)，將卵模圍在中間，子宮出現(xiàn)開始發(fā)育，呈彎曲狀，位于兩縱排泄管的內(nèi)側(cè)，分布于節(jié)片前緣，睪丸數(shù)百個，分布于節(jié)片兩側(cè)縱排泄管之外（圖1-5）；孕節(jié)有排泄管，生殖系統(tǒng)中卵巢、卵模、卵黃腺、睪丸等生殖器官已逐漸退化，子宮中充滿蟲卵占據(jù)了整個節(jié)片（圖1-6），子宮中的蟲卵逐漸發(fā)育成熟。

圖1 曲子宮絳蟲染色標(biāo)本形態(tài)觀察

2.4 生殖器官變化規(guī)律觀察

曲子宮絳蟲生殖系統(tǒng)從幼節(jié)開始分化，最初每個節(jié)片中央有一深色橢圓形的陰影，是生殖器官的萌芽，尚未出現(xiàn)雌、雄的性別特征（圖2-1），隨著發(fā)育節(jié)片位置向后生殖器官萌芽無規(guī)律的向節(jié)片的一側(cè)逐漸移動（圖2-2），生殖系統(tǒng)橢圓形的萌芽逐漸變大，顏色變深。接著雌、雄生殖系統(tǒng)繼續(xù)發(fā)育，在同一節(jié)片中，有生殖孔側(cè)睪丸出現(xiàn)比無生殖孔側(cè)要遲（見圖2-3）。雌性生殖系統(tǒng)中，首先出現(xiàn)生殖腔、卵模和卵黃腺，卵巢從小逐漸變大，與卵黃腺構(gòu)成菜花狀結(jié)構(gòu)（圖2-4），隨著節(jié)片位置向后，這個結(jié)構(gòu)逐漸變大，至此絳蟲成節(jié)發(fā)育完全（圖2-5）。在孕節(jié)發(fā)育過程中，隨著節(jié)片向后延伸，彎曲的子宮開始出現(xiàn)，睪丸最先退化，爾后是卵巢，再是卵黃腺退化，卵模最后退化，節(jié)片內(nèi)僅能看到發(fā)達的子宮中充滿蟲卵，至此絳蟲孕節(jié)發(fā)育完 全（圖2-6）。

圖2 曲子宮絳蟲發(fā)育變化規(guī)律

3 討論

本研究以天祝高山細毛羊小腸內(nèi)寄生的曲子宮絳蟲為實驗材料，用H.E染色法制作了結(jié)構(gòu)清晰、顏色鮮亮、不易褪色的曲子宮絳蟲的染色標(biāo)本，并在光學(xué)顯微鏡下觀察了該絳蟲的縱排泄管、雌雄生殖器官等結(jié)構(gòu)，為該絳蟲形態(tài)學(xué)研究和蟲體鑒定添加了新的參考資料。

絳蟲的染色方法有很多種。裘學(xué)麗等［2］采用齊爾石碳酸復(fù)紅染液對人體內(nèi)的帶絳蟲成蟲進行染色制片效果很好。奚琳琳等［3］和紀(jì)偉華等［4］采用孔雀綠染色法對人體內(nèi)帶絳蟲成蟲的孕節(jié)片進行染色制片，得到的染色標(biāo)本子宮側(cè)枝為亮綠色，其他部位無色，易于觀察。王宏運［5］采用蘇木素染色法制作貝氏莫尼茨絳蟲的染色標(biāo)本，觀察到結(jié)構(gòu)清晰的成節(jié)中雌雄生殖系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)，孕節(jié)中子宮和蟲卵的結(jié)構(gòu)。任成林［6］曾用哈里斯氏蘇木精染色液對羊曲子宮絳蟲成蟲進行染色制片也得到了比較滿意的效果。本實驗采用H.E染色法制作絳蟲的染色標(biāo)本，對傳統(tǒng)的染色方法做了改進。在浸染過程中應(yīng)勤檢查、頻翻動，使染液浸透蟲體，寧可深染，不宜淺染，以免經(jīng)分色后色淡影響鑒定。分色是關(guān)鍵，嚴(yán)格拿握時間，蟲體呈紫紅色為宜。透明時間應(yīng)以最理想的結(jié)果為宜，因此在透明過程中也應(yīng)經(jīng)常觀察，在顯微鏡下能清晰分辨蟲體內(nèi)部各器官，即可取出封片，一般壓制較薄的節(jié)片透明時間短，反之則較長。用此改進的方法制作的曲子宮絳蟲標(biāo)本，成節(jié)中雌雄生殖系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)結(jié)構(gòu)清晰，孕節(jié)中子宮和蟲卵的結(jié)構(gòu)也很好辨認。

湯麗敏［7］對蓋氏曲子宮絳蟲形態(tài)學(xué)進行觀測，測量出了該絳蟲的各種數(shù)據(jù)。本研究就曲子宮絳蟲成蟲從頭節(jié)、頸節(jié)至體節(jié)，總結(jié)了其生殖器官的變化規(guī)律。隨著節(jié)片的生長延伸，節(jié)片變寬變厚，形態(tài)呈現(xiàn)一系列變化，表現(xiàn)為內(nèi)部器官的逐漸發(fā)育完全，一些器官逐漸成熟又逐漸退化的過程。比較曲子宮絳蟲的幼節(jié)和成節(jié)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，生殖器官具有逐漸變化的規(guī)律。幼節(jié)中，每個節(jié)片中央有一深色橢圓形的陰影，是生殖器官的萌芽，尚未出現(xiàn)雌、雄的性別特征，隨著節(jié)片位置向后，生殖器官萌芽無規(guī)律地向節(jié)片的一側(cè)逐漸移動，生殖系統(tǒng)橢圓形的萌芽逐漸變大，顏色變深。在同一節(jié)片中，雌性生殖系統(tǒng)有生殖孔側(cè)睪丸出現(xiàn)比無生殖孔側(cè)要遲，雌性生殖系統(tǒng)中，首先出現(xiàn)生殖腔、卵模和卵黃腺，卵巢從小逐漸變大，與卵黃腺構(gòu)成菜花狀結(jié)構(gòu)，至此絳蟲成節(jié)發(fā)育完全。在孕節(jié)發(fā)育過程中，隨著節(jié)片向后延伸，彎曲的子宮開始出現(xiàn)，睪丸最先退化，爾后是卵巢，再是卵黃腺退化，卵模最后退化，節(jié)片內(nèi)僅能看到發(fā)達的子宮中充滿蟲卵，至此絳蟲孕節(jié)發(fā)育完全。

［1］汪明.獸醫(yī)寄生蟲學(xué)［M］.3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：104-113.

［2］裘學(xué)麗，陳艷，牟榮.帶絳蟲成蟲節(jié)片染色方法的探討［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，30（4）：376.

［3］奚琳琳，楊毅梅.帶絳蟲妊娠節(jié)片孔雀綠染色標(biāo)本制作［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（3）：474.

［4］紀(jì)偉華，郭冀玲.帶絳蟲妊娠節(jié)片標(biāo)本制作方法的研究［J］.中國人獸共患病雜志，2001，17（4）：73-74.

［5］王宏運.貝氏莫尼茨絳蟲幼節(jié)和成節(jié)間差異基因的EST研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2007：11-16.

［6］任成林.絳蟲成蟲染制方法的改進［J］.動物學(xué)雜志，1993，28（6）：28-29.

［7］湯麗敏.蓋氏曲子宮絳蟲形態(tài)學(xué)觀測［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息, 2007，25（10）：26.

S852.7

A

2095-3887（2017）02-0040-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.014

2016-12-25

2016年院列科研項目（2016GMGY002）

楊祎程（1985-），男，碩士，主要從事動物解剖生理教學(xué)與研究工作。

張進?。?966-），男，博士。