呂嬙，姜兆興，王海艷，趙林立，曹旭，崔強(qiáng)，趙治國(guó)，*，郭鐵箏，劉來俊

（1.內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010020；2.赤峰出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古赤峰024000）

疊氮溴化乙錠與PCR技術(shù)結(jié)合檢測(cè)活菌研究進(jìn)展

呂嬙1，姜兆興2，王海艷1，趙林立1，曹旭2，崔強(qiáng)1，趙治國(guó)1，*，郭鐵箏1，劉來俊1

（1.內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010020；2.赤峰出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古赤峰024000）

微生物檢驗(yàn)是食品安全把關(guān)的重要環(huán)節(jié)，而應(yīng)用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測(cè)微生物難以做到及時(shí)、準(zhǔn)確。PCR技術(shù)的出現(xiàn)為微生物快速檢測(cè)開辟了新的途徑，但該方法又難以區(qū)分食品中的死活菌。疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）與PCR技術(shù)相結(jié)合，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中活體微生物，有效減少食品安全事件的發(fā)生。將對(duì)近年來EMA與PCR、RT-PCR和LAMP技術(shù)結(jié)合用于食品中活菌研究進(jìn)展做一綜述。

疊氮溴化乙錠；PCR技術(shù)；活菌

一直以來，食品安全問題都是世界性焦點(diǎn)，食品檢測(cè)是保障人類生命安全與生活質(zhì)量的基礎(chǔ)性工程。我國(guó)食品安全事件頻發(fā)，嚴(yán)重影響了人民群眾的身心健康和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的良性發(fā)展。其中，食源性致病菌微生物危害尤為突出，現(xiàn)有檢測(cè)方法采用常規(guī)培養(yǎng)法檢測(cè)，該方法是多數(shù)微生物檢測(cè)的通用方法，但也有許多難以克服的弊端，一是檢測(cè)靈敏度低，若食品中雜菌多目標(biāo)菌較少，容易發(fā)生漏檢；二是各種菌在平板上形態(tài)各異，檢測(cè)人員需要有一定經(jīng)驗(yàn)才能準(zhǔn)確判定[1]；三是該方法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，甚至檢測(cè)結(jié)果出具時(shí)食品已過保質(zhì)期或已被消費(fèi)者廣泛食用。另外，在我們的檢測(cè)工作過程中發(fā)現(xiàn)，由于食品在加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏中環(huán)境等因素的變化，細(xì)菌容易存活于活的非可培養(yǎng)（Viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)，它是細(xì)菌的一種特殊存活機(jī)制，是對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)[2-3]，由于VBNC菌不可培養(yǎng)的性質(zhì)，急需尋找能替代傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法的方法[4]。

近年來，人們嘗試各種基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法如普通PCR、熒光定量PCR和LAMP檢測(cè)樣品中的致病菌，但由于食品樣品DNA在死菌中能保留較長(zhǎng)時(shí)間，傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)法并不能區(qū)分死活菌。鑒于mRNA的半衰期較短，一般只存在于活體細(xì)胞中，是活菌檢測(cè)的新路徑。然而mRNA易受食品基質(zhì)中各種成分如脂肪、血細(xì)胞和蛋白質(zhì)的影響而不易被提取，從而使檢測(cè)靈敏度降低。疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）的發(fā)明為基于DNA檢測(cè)活菌開辟了新的思路，它在光激活作用下能與死細(xì)胞基因組DNA結(jié)合并抑制其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而由于完整未受損傷的活菌細(xì)胞膜能夠阻止EMA的滲透，對(duì)活菌DNA則不起作用。目前，將EMA與普通PCR、熒光定量PCR、LAMP等技術(shù)結(jié)合用于食品中活菌檢測(cè)已成為研究熱點(diǎn)。

1 EMA簡(jiǎn)介

疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）是Hixon等[5]發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)70年代的核酸熒光染料，分子式為C21H18BrN5，分子量為420，不溶于水、可溶于乙醇的橙色固體。其特點(diǎn)是當(dāng)樣品中死活細(xì)胞共同存在時(shí)，能選擇性地與死細(xì)胞DNA共價(jià)結(jié)合[6]。其主要原理是：通常死細(xì)胞的細(xì)胞膜已經(jīng)遭到破壞，EMA很容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部從而插入到細(xì)胞內(nèi)DNA雙螺旋上。但活菌的細(xì)胞膜比較完整，EMA不能滲透到活菌內(nèi)部。后續(xù)經(jīng)過高強(qiáng)度的可見光曝光處理后，插入到DNA雙螺旋上的EMA能夠與DNA雙螺旋發(fā)生共價(jià)交叉偶合，且這種共價(jià)偶合具有不可逆性，從而抑制后續(xù)PCR擴(kuò)增中引物與死菌DNA的結(jié)合，達(dá)到區(qū)分死活菌的目的[7]。

以EMA-PCR為例說明：將EMA加入到含有活菌和死菌的測(cè)試樣品中，曝光1min導(dǎo)致游離EMA穿透死亡細(xì)胞并與DNA共價(jià)結(jié)合，但不能進(jìn)入活細(xì)胞。與EMA共價(jià)結(jié)合的死細(xì)胞DNA和未與EMA結(jié)合的活細(xì)胞DNA，在PCR反應(yīng)中，來自活細(xì)胞的DNA是可以與引物結(jié)合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而死細(xì)胞DNA由于與EMA的不可逆結(jié)合不能被擴(kuò)增[8]。

2 EMA在區(qū)分死活菌中的應(yīng)用

2.1 EMA與PCR技術(shù)

1985年，Randal等[9]首次在science發(fā)表聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reactiom，PCR），它是一種體外核酸序列擴(kuò)增技術(shù)。PCR是在模板DNA、四種脫氧核糖核苷酸和引物存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，經(jīng)過雙鏈DNA的高溫變性、引物與模板的低溫退火和適溫延伸3個(gè)步聚反復(fù)循環(huán)，PCR的特定DNA序列產(chǎn)量隨著循環(huán)次數(shù)呈指數(shù)增加，達(dá)到迅速大量擴(kuò)增目的[10]。PCR技術(shù)已在分子生物學(xué)、法學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

將EMA與PCR技術(shù)聯(lián)用可以克服傳統(tǒng)PCR無法區(qū)分死活菌的缺點(diǎn)[11]。目前EMA-PCR方法已用于多種致病菌的檢測(cè)。2005年，Knut等[8]在檢測(cè)經(jīng)過滅菌和抗生素處理的復(fù)雜食品中難以培養(yǎng)的細(xì)菌時(shí)，EMA-PCR法起到了良好的效果。2006年，Jung-Lim等[12]利用EMA處理鱈魚片肉湯培養(yǎng)物的細(xì)菌混合菌群后，用通用引物DG74和RW01擴(kuò)增所有真細(xì)菌16S rDNA的高度保守區(qū)的序列片段（約370 bp），結(jié)果較為理想。2010年，Minami等[13]通過小劑量的EMA處理，檢測(cè)嬰兒配方食品中活的阪崎腸桿菌。2013年，Saiyudthong等[14]研究雞肉中鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）和腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis）時(shí)，將雞肉樣品在營(yíng)養(yǎng)肉湯中預(yù)培養(yǎng)，微生物得到大量繁殖后，再利用EMA-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，使檢測(cè)結(jié)果更加可靠。2015年，Hiroaki等[15]采用EMA-PCR方法分析來自6個(gè)冷卻塔和3個(gè)洗浴水樣的軍團(tuán)菌屬多樣性，針對(duì)將617個(gè)16S rRNA基因序列分為99個(gè)操作分類單位（OTUs），且與VBNC狀態(tài)培養(yǎng)的細(xì)菌具有差異性。大量研究證實(shí)，EMA確實(shí)能穿過死細(xì)菌不完整的細(xì)胞膜與基因組DNA結(jié)合，“屏蔽”死細(xì)胞和游離狀態(tài)的DNA，使其不能作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2 EMA與熒光定量PCR技術(shù)

1996年，Applied Biosystems公司首次推出熒光定量 PCR技術(shù)（Real Time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）。熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的積累，最后通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知濃度樣品進(jìn)行定量分析的技術(shù)。該方法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR技術(shù)不能定量的不足，具有特異性好、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、自動(dòng)化程度高和速度快等優(yōu)點(diǎn)，并且實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍[16]。

近年來，關(guān)于EMA與實(shí)時(shí)RT-PCR相結(jié)合定量檢測(cè)食品中致病菌活細(xì)胞的研究報(bào)道比較多。2005年，Rudi等[17]采用EMA與熒光定量PCR法結(jié)合用于檢測(cè)活、死的和VBNC狀態(tài)下的荷蘭產(chǎn)高德干酪（gouda-like cheeses）中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。2009 年，Helen 等[18]采用相同的方法檢測(cè)果汁發(fā)酵過程中敗壞酵母（Zygosaccharomyces bailii）的產(chǎn)生過程。同年，Wang[19]分別用EMA與熒光定量PCR結(jié)合法、反轉(zhuǎn)錄RNA擴(kuò)增法和熒光定量PCR法對(duì)禽肉和牛肉制品中大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明EMA與熒光定量PCR結(jié)合法檢測(cè)效率最好。2010年，Wang等[20]采用EMA與熒光定量PCR結(jié)合法檢測(cè)雞肉和雞蛋培養(yǎng)液中沙門氏菌，檢測(cè)低限可達(dá)10 CFU/mL。Meng[21]分別用EMA與熒光定量PCR結(jié)合法和平板計(jì)數(shù)法定量檢測(cè)雙歧桿菌，結(jié)果表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果有良好的相關(guān)性（R2=0.994 8），EMA與熒光定量PCR結(jié)合法可直接、快速（4 h內(nèi)）完成商業(yè)酸奶中活的雙歧桿菌檢測(cè)。2012年，Soejima等[22]采用EMA與熒光定量PCR結(jié)合法，擴(kuò)增較長(zhǎng)片段16S-23S rRNA基因序列（2 451 bp），分析巴氏殺菌乳總大腸菌群。Shi等[23]采用玻璃珠DNA提取方法和EMA與熒光定量PCR結(jié)合法檢測(cè)葡萄酒中微生物，如酵母、釀酒酵母、乳酸菌（LAB）、乙酸菌（AAB）和非酒花（oeniLAB）的測(cè)定。2014年，Seinige等[24]將EMA與熒光定量PCR結(jié)合法成功應(yīng)用于水樣中彎曲桿菌的分離與鑒定，結(jié)果表明該法對(duì)死活菌混合物的檢測(cè)優(yōu)于熒光定量PCR法。

2.3 EMA與LAMP技術(shù)

2000年，Notomi等[25]首次提出環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) （loop-mediated isothermal amplification，簡(jiǎn)稱LAMP），它是針對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條LAMP特異性引物，利用DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）在恒溫條件下保溫約60 min進(jìn)行擴(kuò)增。目前，已有EMA-LAMP技術(shù)成功用于食源性病原菌檢測(cè)的報(bào)道。2009年，Lu等[26]采用EMA-LAMP分析沙門氏菌的invA基因序列。2012年，Wang等[27]采用相同的方法擴(kuò)增tlh基因檢測(cè)VBNC狀態(tài)下的副溶血性弧菌，來自死菌的DNA擴(kuò)增被EMA成功抑制，而處于VBNC狀態(tài)下菌株被成功擴(kuò)增出來。2015年，Wu等[28]采用EMA與Real Time-LAMP結(jié)合的方法研究食源性致病菌腸炎沙門氏菌，并通過不斷試驗(yàn)優(yōu)化選擇了最佳的EMA濃度。

綜上所述，EMA與分子生物學(xué)方法結(jié)合在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，但也有一些弊端，研究學(xué)者Kobayashi等[29]采用EMA與熒光定量PCR結(jié)合法分析葡萄球菌屬的tuf基因，表明EMA并不是可以將所有死活菌可靠區(qū)分，如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，可能原因是該細(xì)菌細(xì)胞壁較厚。研究表明，一定濃度的表面活性劑在較低濃度下能顯著改變細(xì)菌的表面性質(zhì)，具有增加細(xì)胞膜通透性的能力[30]，可以有效補(bǔ)充該方法對(duì)個(gè)別細(xì)菌死活菌難以區(qū)分的弊端。另外，反復(fù)凍融也可以使細(xì)菌細(xì)胞膜破裂，Lee等[31]擴(kuò)增來自鱈魚塊細(xì)菌16S rDNA保守區(qū)域的序列，表明反復(fù)凍融破碎法導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷，通過共聚焦顯微鏡顯示EMA更容易穿透到細(xì)菌中。同時(shí)，使用其他的核酸插入活力染料疊氮溴化丙錠（PMA），將EMA和PMA在應(yīng)用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)前進(jìn)行預(yù)處理[32-35]。

3 展望

EMA與普通PCR、熒光定量PCR和LAMP等技術(shù)結(jié)合用于食品中死活菌的檢測(cè)效果可靠，集快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和EMA抑制死菌DNA擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)于一體，不僅在檢測(cè)食品中對(duì)人體有害的活體微生物方面應(yīng)用前景廣泛，在水體微生物、環(huán)境微生物和人畜病原早期快速檢測(cè)等方面應(yīng)用潛力巨大[36-38]。2015年，Gorzata等[39]研究熒光定量PCR可以定量診斷廢水中的死活微生物（大腸桿菌和沙門氏菌），其中EMA預(yù)處理是定量分析活菌的關(guān)鍵步驟。2007年，Pisz等[40]采用EMA與熒光定量PCR結(jié)合研究環(huán)境樣品中的死活菌。2015年，Moreno等[41]采用EMA/PMA與熒光定量PCR結(jié)合研究甲型肝炎病毒（HAV）的感染與傳播。

從分子層面上來看，DNA檢測(cè)歷經(jīng)了普通PCR和熒光定量PCR方法，實(shí)現(xiàn)DNA從定性到相對(duì)定量的檢測(cè)。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是近年來發(fā)展起來基于核酸分子的絕對(duì)定量檢測(cè)技術(shù)，該方法在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前將含有核酸分子的反應(yīng)體系進(jìn)行有效分割，通過PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)的積累讀取陽(yáng)性反應(yīng)單元數(shù)，再通過泊松分布計(jì)算出樣本的DNA分子數(shù)目[42-44]。dPCR的定量檢測(cè)限比傳統(tǒng)定量PCR低，特異性和重復(fù)性和傳統(tǒng)定量PCR也存在極大的優(yōu)勢(shì)。鑒于這種微滴反應(yīng)能極大程度分散反應(yīng)體系，可以有效消除抑制因子的作用，保證檢測(cè)過程中的擴(kuò)增效率，對(duì)檢測(cè)低含量目標(biāo)核酸分子的樣品有良好的效果[45]。因此，在后續(xù)的研究中，可以將EMA與數(shù)字PCR結(jié)合，用于活體微生物絕對(duì)定量檢測(cè)。

[1]倫鏡盛,夏常艷,羅鵬,等.副溶血弧菌EMA-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立[J].微生物學(xué)通報(bào),2011,38(6):952-956

[2]趙紅波,熊麗娜,莫自耀.熒光定量PCR結(jié)合EMA/FPMA染色法快速檢測(cè)軍團(tuán)菌活菌[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2013,23(7):1661-1664

[3]Wang C X,Esteve-Zarzoso B,Cocolin L,et al.Viable and culturable populations of Saccharomyces cerevisiae,Hanseniaspora uvarum and Starmerella bacillaris (synonym Candida zemplinina)during Barbera must fermentation[J].Food Research International,2015,78:195-200

[4]顏成英,湯曉艷,康大成,等.EMA RT-PCR法檢測(cè)雞肉中鼠傷寒沙門氏菌活菌[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2015,15(10):179-184

[5]Hixon S C,White W E,Yielding K L,et al.Selective covalent binding of an ethidium analog to mitochondrial DNA with production of petitemutantsinyeast byphotoaffinitylabeling[J].Journal of Molecular Biology,1975,92(2):319-329

[6]顏成英,湯曉艷,王敏,等.腸炎沙門氏菌EMA-PCR檢測(cè)方法的建立[J].食品科學(xué),2014,35(6):90-93

[7]祝儒剛,呂淑霞,劉月萍,等.基于DNA染料EMA的PCR技術(shù)檢測(cè)鑒別副溶血性弧菌死活細(xì)胞[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(7):144-149

[8]Knut R,Birgitte M,Signe M D,et al.Use of ethidium monoazide and PCR in combination for quantification of viable and dead cells in complex samples[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(2):1018-1024

[9]Randall K,Saiki,Stephen S,et al.Enzymatic amplification of β-Globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia[J].Science,1985,230(4732):1350-1354

[10]熊書,殷幼平,王芳,等.基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活體檢測(cè)技術(shù)的建立[J].微生物學(xué)通報(bào),2013,40(9):1723-1732

[11]梅玲玲,徐昌平,楊勇,等.食品中志賀活菌疊氮溴乙錠實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)研究[J].疾病監(jiān)測(cè),2016,31(11):909-914

[12]Jung-Lim L,Robert E L.Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction[J].Journal of Microbiological Methods,2006,67(3):456-462

[13]Minami J,Yoshida K,Soejima T,et al.New approach to use ethidium bromide monoazide as an analytical tool[J].Journal of Applied Microbiology,2010,109(3):900-909

[14]Saiyudthong S,Trevanich S.An optimized EMA-RAPD-PCR for a reliable detection of viable Salmonella spp.in chicken products[J].Journal of Food Safety,2013,33(3):247-259

[15]Hiroaki I,Reiko F,Kunio A,et al.Molecular characterization of viable Legionella spp.in cooling tower water samples by combined use of ethidium monoazide and PCR[J].Microbes and Environments,2015,30(1):108-112

[16]余秋陽(yáng),歐陽(yáng)效鵬,尚靜曄,等.EMA-RTQ-PCR快速鑒別沙門菌死活細(xì)胞方法的建立[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2015,42(12):2226-2229

[17]Rudi K,Naterstad K,Dr?mtorp S M,et al.Detection of viable and dead Listeria monocytogenes on gouda-like cheeses by real-time PCR[J].Letters in Applied Microbiology,2005,40(4):301-306

[18]Helen R,Trevor G P.Detection of viable Zygosaccharomyces bailii in fruit juices using ethidium monoazide bromide and real-time PCR[J].International Journal of Food Microbiology,2009,131(2):246-250

[19]Wang L X.Novel PCR-based rapid detection strategies for Escherichia coli O157:H7 and Salmonella in meat products[M].Microbiology,2009

[20]Wang L X,Mustapha A.EMA-Real-Time PCR as a reliable method for detection of viable Salmonella in chicken and eggs[J].International Journal of Food Microbiology,2010,75(3):134-139

[21]Meng X C,Pang R,Wang C,et al.Rapid and direct quantitative detection of viable bifidobacteria in probiotic yogurt by combination of ethidium monoazide and real-time PCR using a molecular beacon approach[J].Journal of Dairy Research,2010,77(4):498-504

[22]Soejima T,Minami J I.An advanced PCR method for the specific detection of viable total coliform bacteria in pasteurized milk[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2012,95(2):485-497

[23]Shi H,Xu W,Trinh Q,et al.Establishment of a viable cell detection system for microorganisms in wine based on ethidium monoazide and quantitative PCR[J].Food Control,2012,27(1):81-86

[24]Seinige D,K?ckritzblickwede M V,Krischek C,et al.Influencing factors and applicability of the viability EMA-qPCR for a detection and quantification of campylobacter cells from water samples[J].Plos one,2014,9(9):e113812-113812

[25]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research,2000,28(12):e63-63

[26]Lu Y,Yang W,Shi L,et al.Specific detection of viable Salmonella cells by an ethidium monoazide-loop mediated isothermal amplification (EMA-LAMP)method[J].Journal of Health Science,2009,55(5):820-824

[27]Wang L,Zhong Q.Ethidium monoazide-loop mediated isothermal amplification for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus in viable but non-culturable state[J].Energy Procedia,2012,17:1858-1863

[28]Wu G P,ChenS H.Application of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead cells of Salmonella enterica by real-time loop-mediated isothermal amplification[J].Journal of Microbiological Methods,2015,117:41-48

[29]Kobayashi H,Oethinger M,Tuohy M J,et al.Unsuitable distinction between viable and dead Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis by ethidium bromide monoazide[J].Letters in Applied Microbiology,2009,48(5):633-638

[30]張超,呂淑霞,于曉丹,等.脫氧膽酸鈉在副溶血性弧菌死活細(xì)胞疊氮溴乙錠PCR鑒別中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2013,40(7):1297-1304

[31]Lee J L,Levin L E.Fillets after freezing and thawing by ethidium bromide monoazide Real-Time PCR[J].Food Biotechnology,2010,24(3):270-281

[32]Cocolin L,Alessandria V,Dolci P,et al.Culture independent methods to assess the diversity and dynamics of microbiota during food fermentation[J].International Journal of Food Microbiology,2013,167(1):29-43

[33]Bellehumeur C,Boyle B,CharetteS J,et al.Propidium monoazide(PMA)and ethidium bromide monoazide(EMA)improve DNA array and high-throughput sequencing of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus identification[J].Journal of Virological Method,2015,222(6):182-191

[34]Hru?ková L,Mot'ková P,Vytrasová J.Multiplex polymerase chain reaction using ethidiummonoazide and propidium monoazide for distinguishing viable and dead cells of arcobacters in biofilm[J].Canadian Journal of Microbiology,2013,59(12):797-802

[35]Wagner A O,Praeg N,Reitschuler C,et al.Effect of DNA extraction procedure,repeated extraction and ethidium monoazide(EMA)/propidium monoazide (PMA)treatment on overall DNA yield and impact on microbial fingerprints for bacteria,fungi and archaea in a reference soil[J].Applied Soil Ecology,2015,93(2):56-64

[36]Nocker A,Camper AK.Selective removal of DNA from dead cells of mixed bacterial communities by use of ethidium monoazide[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72(3):1997-2004

[37]Jola M P,John R L.Development of a quantitative PCR method to differentiate between viable and nonviable bacteria in environmental water samples[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2009,82(3):587-596

[38]Fijalkowskia K L,Kacprzaka M J,Rorata A.Occurrence changes of Escherichia coli(includingO157:H7 serotype)in waste water and sewage sludge by quantitation method of(EMA)real time-PCR[J].Desalination and Water Treatment,2014,52(19/21):3965-3972

[39]Gorzata K M,Krzysztof F,Anna G,et al.Escherichia coli and Salmonella spp.early diagnosis and seasonal monitoring in the sewage treatment process by EMA-qPCR method[J].Polish Journal of Microbiology,2015,64(2):143-148

[40]Pisz J M,Lawrence J R,Schafer A N,et al.Differentiation of genes extracted fromnon-viable versus viable micro-organisms in environmental samples using ethidium monoazide bromide[J].Journal of microbiological methods,2007,71(3):312-318

[41]Moreno L,Aznar R.Application of viability PCR to discriminate the infectivity of hepatitis A virus in food samples[J].International Journal of Food Microbiology,2015,201(1):1-6

[42]Morisset D,?tebih D,Milavec M,et al.Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR[J].PLos One,2013,8(5):62583-62588

[43]George D,Czech J,John B,et al.Detection and quantification of chimerism by droplet digital PCR[J].Chimerism,2013,4(3):102-108

[44]Beck J,Bierau S,Balzer S,et al.Digital droplet PCR for rapid quantification of donor DNA in the circulation of transplant recipients as a potential universal biomarker of graft injury[J].Clinical Chemistry,2013,59(12):1732-1741

[45]Floren C,Wiedemann I,Brenig B,et al.Species identification and quantification in meat and meat products using droplet digital PCR(ddPCR)[J].Food Chemistry,2015,173:1054-1058

Advances in Detection of Viable Bacteria Using Ethidium Monoazide Bromide and PCR Technology

Lü Qiang1，JIANG Zhao-xing2，WANG Hai-yan1，ZHAO Lin-li1，CAO Xu2，CUI Qiang1，ZHAO Zhi-guo1，*，GUO Tie-zheng1，LIU Lai-jun1
（1.The Inspection and Quarantine Technology Center of Inner Mongolia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hohhot 010020，Inner Mongolia，China；2.Chifeng Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chifeng 024000，Inner Mongolia，China）

Microbiological examination plays an important part in food safety，but based on the traditional culture method is difficult to achieve result timely and accurate.PCR technology has opened up a new way for the rapid detection of microbes，however，it can not distinguish the dead and viable bacteria.Ethidium monoazide bromide （EMA）combined with PCR，can rapidly and accurately detect viable microorganisms from food，therefore reducing the incidence of food safety incidents.In this review，we summarized recent progresses on EMA combined with PCR，RT-PCR and LAMP technology for detecting the viable bacteria in food.

Ethidium monoazide bromide；PCR technology；viable bacteria

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.043

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016IK165）

呂嬙（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：趙治國(guó)（1983—），男（蒙古），高級(jí)獸醫(yī)師，研究方向：食品安全與動(dòng)物檢疫。

2017-04-01