張穎穎 ,付業(yè)佩 ,王 萍

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250355；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2016級研究生，山東 濟南 250355)

羅勒多糖抗菌作用研究

張穎穎1*,付業(yè)佩2,王 萍2

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250355；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2016級研究生，山東 濟南 250355)

目的:研究羅勒多糖對幾種常見致病細(xì)菌的抗菌活性。方法 采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行檢驗。結(jié)果:羅勒多糖對金黃色葡萄球菌(含MRSA)、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、普通變形桿菌、糞腸球菌及肺炎克雷伯菌等各菌都有較好的抗菌效果，對MRSA的抗菌能力最為突出，抗銅綠假單胞菌的效果較差。

羅勒；多糖；抗菌；MIC

羅勒(OcimumbasilicumL.)屬于唇形科(Lamiaceae) 羅勒屬，是藥食兩用植物之一，屬于一年生草本，主要分布于中國云南等南部省份及西部新疆等省份；國外主要分布于東南亞地區(qū)及南美洲、非洲部分地區(qū)。羅勒全草和種子藥用價值較高，有疏風(fēng)解表、強心安神、行氣活血、解毒消腫、散瘀止痛等作用，可用于感冒、咳嗽、中暑、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷等各種疾病的治療[1]。國內(nèi)外藥理研究證實，羅勒不同提取物分別有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、降血脂和降血糖、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等活性作用。Koffi Kobal[2]等人研究發(fā)現(xiàn)，羅勒中含有的甲基丁香酚、茴香腦類等成分可有效抑制細(xì)菌生長；G.Opalchenova等發(fā)現(xiàn)羅勒對金黃色葡萄球菌屬、腸球菌屬和假單胞菌均有較好抑制效果[3]；Prakash Chandra Gupta等發(fā)現(xiàn)羅勒甲醇提取物抑菌效果最佳，提示羅勒可作為防腐劑的來源[4]。Klaudija Carovic-Stanko等人對羅勒揮發(fā)油進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其可抑制O157：H7型大腸埃希菌，可用于出血性腸炎及溶血性尿毒綜合征的治療[5]。上述研究中，多以羅勒醇提物、揮發(fā)油等為研究對象，而對羅勒多糖的研究集中于抗腫瘤方面[6]，抗菌研究相對較少。故此，本文以多種臨床常見細(xì)菌為對象，對羅勒多糖的抗菌作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示該多糖具有一定的抗菌效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 羅勒多糖制備

羅勒藥材粉碎，用85%乙醇脫脂，隨后用水煎煮，提取2次，合并濾液，以95%乙醇醇沉2次，將沉淀物真空干燥，得到羅勒粗多糖成品。用無菌生理鹽水配制成10mg/mL的溶液，0.22μm無菌濾器過濾備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

實驗所用培養(yǎng)基有營養(yǎng)瓊脂(批號20170406001)和MH肉湯(批號20170406001)，均由杭州百思生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。以上培養(yǎng)基均按說明書配制，并按要求高壓蒸汽滅菌后備用。

1.1.3 實驗細(xì)菌

實驗所用菌株由山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院微生物教研室保存?zhèn)溆?。菌種共有16株，包含金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(B)26003，臨床分離MRSA 5株；大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(B)44102，臨床分離4株(ESBL+/ESBL-各2株)；銅綠假單胞菌CMCC(B)10104、枯草芽胞桿菌CMCC(B)63501、糞腸球菌ATCC 29212、普通變形桿菌CMCC(B)49027、肺炎克雷伯菌CMCC(B)46117，以上各菌株以營養(yǎng)瓊脂進(jìn)行接種，37℃24h培養(yǎng)后挑取菌苔以生理鹽水配成1×106cfu/mL的對應(yīng)菌液備用。

1.2 實驗方法

采用NCCLS推薦的微量稀釋法[7]，在此基礎(chǔ)上稍有改動，使用96孔培養(yǎng)板測定羅勒多糖的MIC(最小抑菌濃度)。按照文獻(xiàn)方法，進(jìn)行藥物倍比稀釋[8]。羅勒多糖原始濃度為10mg/mL，經(jīng)遞倍稀釋得到2-256倍稀釋梯度。另單獨設(shè)置陰性對照，直接加入菌液，觀察生長現(xiàn)象。同時設(shè)立藥物稀釋梯度孔和MH肉湯空白孔以輔助對比。陽性對照孔各加入慶大霉素注射液10μL。以上藥液和對照加樣完畢后，每孔加入1×106 cfu/mL的對應(yīng)菌液10μL，每個藥物重復(fù)3次，37℃培養(yǎng)24h，以酶標(biāo)儀對培養(yǎng)板在600nm波長下測定 OD值，結(jié)合細(xì)菌生長情況判斷實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

經(jīng)37℃24h培養(yǎng)后，慶大霉素陽性對照孔中無明顯細(xì)菌生長，陰性對照孔中肉眼可見明顯渾濁，說明陽性對照有效，陰性對照細(xì)菌生長良好；MH肉湯空白孔中無明顯生長現(xiàn)象，證明培養(yǎng)基無污染。其他各孔測定結(jié)果見表1。

2.1 羅勒多糖抗菌實驗結(jié)果(見表1)

由表1可見，羅勒多糖對不同菌株均有一定的抗菌效果。對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及MRSA臨床分離株均有明顯的抗菌效果，其中標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC為0.625 mg/mL，臨床分離MRSA中的MIC在0.625～1.25mg/mL之間，抗菌效果較好。銅綠假單胞菌CMCC(B)10110的MIC是5.0mg/mL；大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC是2.5mg/mL，ESBL+/ESBL-是1.25～5.0mg/mL，不同菌株之間差異較大；其他如枯草芽胞桿菌、普通變形桿菌、糞腸球菌及肺炎克雷伯菌等的MIC在1.25～2.5mg/mL之間。

3 討論

國內(nèi)外研究顯示，羅勒提取物具有具有抗菌、抗氧化、抗血栓、降血糖、降血脂、抑制腫瘤生長等多方面的藥理活性[9]。國內(nèi)外對羅勒的抗菌作用做了初步研究，發(fā)現(xiàn)羅勒水提物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌抑制效果較好，醇提物對霍亂弧菌亦有明顯的效果。臨床觀察證實，羅勒注射液具有抗菌消炎、防治感染等作用，而且使用安全可靠[10]。

金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌都可通過創(chuàng)傷感染，屬于臨床常見感染菌。銅綠假單胞菌耐藥性強，臨床中該菌所致感染病例比例逐年上升，其耐藥性導(dǎo)致治療難度較大[11]。MRSA是臨床常見耐藥菌之一，基因組中固有耐藥序列及耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移等因素是其耐藥的主要機制。隨著各種抗生素的普遍應(yīng)用，其引發(fā)的臨床感染比例越來越高。該菌易在人體內(nèi)繁殖，可降低機體免疫力，嚴(yán)重感染者可能出現(xiàn)膿毒血癥等繼發(fā)感染[12]。大腸埃希菌、普通變形桿菌、糞腸球菌及肺炎克雷伯菌均可通過腸道感染，引起各種疾病；枯草芽胞桿菌可污染食物，引起腐敗變質(zhì)。

本實驗中，羅勒多糖顯示出了較為廣泛的抗菌譜，對多種常見臨床感染細(xì)菌都有一定抑制效果。其中，羅勒多糖對大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、普通變形桿菌、糞腸球菌及肺炎克雷伯菌等菌有相對較好的抗菌效果，尤其是對MRSA表現(xiàn)出了較強的抗菌能力，未受其耐藥機制的影響。但羅勒多糖對個別大腸埃希菌臨床株抗菌效果較弱，且不同菌株間有較大差異；對銅綠假單胞菌抗菌效果較差。

羅勒為藥食兩用植物，即是開發(fā)食品的有效原材料，又可廣泛用于醫(yī)藥生產(chǎn)。有鑒于此，羅勒多糖的抗菌潛力可應(yīng)用于臨床藥物的開發(fā)，亦可用于食品中研制新型生物防腐劑，對制藥工業(yè)及食品工業(yè)的研發(fā)均有較高價值。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局.《中華本草》編委會. 中華本草: 第七分冊[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1997:6118-6 120.

[2] Kobal Koffi, Poutiouli P W, Raynaud Christine, et al. Chemical composition and antimicrobial properties of different basil essential oils chemotypes from Togo[J].Bangladesh J Pharmacol,2009,4(6):1-8.

[3] Opalchenova G, Obreshkova D. Comparative studies on the activity of basil-an essential oil fromOcimumbasilicumL Against multidrug resistant clinical isolates of the generaStaphylococus,EnterococcusandPseudomonasby using different test methods[J]. Journal of Microbiological Methods, 200354(6):105-110.

[4] Gupta Prakash Chandra, Batra Ritu, Chauhan Abhishek,et al. Antibacterial activity and TLC Bioautography of Ocimum basilicum L Against pathogenic bacteria[J]. Journal of Pharmacy Research,2009,2(3):407-409.

[5] Klaudija Carovic Stanko,Sandi Orlic, Olivera Politeo, et al. Composition and antibacterial activities of essential oils of seven[J]. Ocimum taxa.Food Chemistry,2010,119(1):196-201.

[6] 曲 迅,楊美香,鄭廣娟,等. 羅勒多糖對腫瘤轉(zhuǎn)移行為的影響[J]. 中國腫瘤生物治療雜志,2004,11(l) : 31-35．

[7] NCCLS. NCCLS document M27-A2 Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts[S]．Pennsylvania: NCCLS, 2002：1-29.

[8] 王新紅,殷 麗,魏 娟,張麗梅,廖晚霞,羅 薇.西吡氯銨漱口液對銅綠假單胞菌和MRSA的抗菌活性研究[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2015,31(09):1389-1391.

[9] 楊志杰, 李秀麗. 中藥羅勒的研究進(jìn)展[J]．世界中醫(yī)藥,2013,8(8):976-978．

[10] 中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院藥局．羅勒在動物體內(nèi)抑菌實驗研究及臨床療效觀察[J]．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1977, 8(7):27-30．

[11] 王文晶，黃 茂，趙旺勝，等．下呼吸道感染銅綠假單胞菌流行和耐藥現(xiàn)狀分析[J]．實用臨床醫(yī)藥雜志，2006, 10(3):33-36.

[12] Haque N Z, Zuniga L C, Peyrani P, et al．Relationship of vancomycin minimum inhibitory concentration to mortality in patients with methicillin-resistant Staphylococcus aureus hospital-acquired，ventilator-associated，or health-care-associated pneumonia[J].Chest,2010, 138(6):1356-1362．

(本文文獻(xiàn)格式：張穎穎,付業(yè)佩,王萍.羅勒多糖抗菌作用研究[J].山東化工，2017，46(20)：6-7.)

ResearchontheAntibacterialActionofOcimumBasilicumL.Polysaccharide

ZhangYingying1,FuYepei2,WangPing2

(1. College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. 2016 graduate student, College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China)

Objective:To study the in vitro antimicrobial activity against certain clinical bacterias. Methods: Micro both dilution method. Results:The inhibition of Ocimum basilicum L. polysaccharide onStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Bacillussubtilis,Proteusvulgaris,Enterococcusfaecalis,Klebsiellapneumoniaeare obvious, Especially for MRSA, it showed strong antibacterial ability, and the antibacterial effect againstPseudomonasaeruginosawas weak.

Ocimum basilicum L.; polysaccharide; antibacterial; MIC

2017-09-14

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(2015-116)

張穎穎(1977—)，山東日照人，碩士研究生，山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，講師，主要從事醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研工作。

R781.54

A

1008-021X(2017)20-0006-02