潘曉倩，張順亮，李素，趙婉婧，喬曉玲，陳文華，李家鵬，曲超，趙燕*

中溫醬牛肉中腐敗菌的分離鑒定與防腐劑對(duì)其抑制作用

潘曉倩1，張順亮1，李素1，趙婉婧2，喬曉玲1，陳文華1，李家鵬1，曲超1，趙燕1*

（1.中國(guó)肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100068；2.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京102206）

將真空包裝中溫醬牛肉置于25℃條件下貯藏，對(duì)其中的腐敗細(xì)菌進(jìn)行分離和鑒定，并通過(guò)管碟法分析肉制品中常用的7種防腐劑對(duì)這些菌株的抑菌作用。結(jié)果表明，從細(xì)菌總數(shù)平板上共分離出9株菌落形態(tài)不同的微生物菌株，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)其由5株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、3株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和1株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）組成。乳酸鈉、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、雙乙酸鈉和乳酸鏈球菌素（Nisin）對(duì)9株腐敗菌普遍具有較明顯的抑菌活性，而山梨酸鉀、亞硝酸鈉和脫氫乙酸鈉抑菌效果相對(duì)較差。

中溫殺菌；醬牛肉；腐敗菌；分離鑒定；防腐劑

醬鹵肉制品是深受我國(guó)消費(fèi)者歡迎的一種中式傳統(tǒng)肉制品，歷史悠久，其中醬牛肉因其營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特而備受推崇[1]。但傳統(tǒng)醬牛肉多屬于低溫肉制品范疇，存在貨架期短、不便于長(zhǎng)途運(yùn)輸及常溫貯藏等缺點(diǎn)[2]。如采用高溫高壓殺菌（121℃熱加工）能夠達(dá)到商業(yè)無(wú)菌，貨架期延長(zhǎng)，但風(fēng)味[3-4]、口感[5]、營(yíng)養(yǎng)[6]等均受到不同程度的損害。中溫肉制品是近年來(lái)一種新興的肉制品產(chǎn)品形式，指經(jīng)過(guò)溫度90～110℃條件下殺菌，并聯(lián)合其他抑菌保鮮和品質(zhì)保持技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品[7]。與其他兩種殺菌方式相比，中溫殺菌能夠有效降低產(chǎn)品的初始菌數(shù)，達(dá)到常溫流通及貯存的目的，又很大程度地避免了肉制品風(fēng)味、口感和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)被破壞，更能滿足消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)肉制品的需求。然而，中溫殺菌雖然能夠殺滅絕大部分細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，但會(huì)殘留一些芽孢菌等少數(shù)耐熱微生物[8]，在室溫25℃貯藏條件下，這些未完全被殺滅的微生物經(jīng)過(guò)短暫的修復(fù)、適應(yīng)后將重新生長(zhǎng)繁殖，最終引發(fā)產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)[9]。

引起肉制品腐敗變質(zhì)的微生物構(gòu)成十分復(fù)雜[10]，國(guó)內(nèi)外研究多集中于低溫熟肉制品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌方面[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌是引起真空包裝低溫熟肉制品腐敗的主要微生物，包括乳桿菌屬、明串珠菌屬和魏絲菌屬[13-14]，其次是假單胞菌、芽孢桿菌、熱死環(huán)絲菌和腸桿菌等[15-16]。劉勤華等[1]研究發(fā)現(xiàn)，真空包裝醬牛肉中腐敗細(xì)菌包括乳酸菌、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬等；孫承鋒等[17]則發(fā)現(xiàn)，巴氏殺菌醬牛肉中乳酸菌是優(yōu)勢(shì)菌，其余為葡萄球菌和芽孢桿菌，腸桿菌、假單胞菌和熱死環(huán)絲菌幾乎不存在；非真空包裝醬牛肉低溫貯存時(shí)的主要腐敗細(xì)菌包括葡萄球菌屬、腸桿菌科及熱死環(huán)絲菌，假單胞菌所占比例很小[2]。熟肉制品腐敗微生物的菌相構(gòu)成，取決于產(chǎn)品初始菌群污染的種類和數(shù)量，肉制品組分和殺菌工藝條件等[18-19]。此外，同種產(chǎn)品在不同包裝方式和貯藏流通條件下，腐敗菌菌相構(gòu)成也會(huì)發(fā)生變化[20-22]。

本實(shí)驗(yàn)以中溫殺菌醬牛肉為研究對(duì)象，按照國(guó)標(biāo)規(guī)定測(cè)定其貯藏期間菌落總數(shù)變化，并從腐敗樣品中分離、培養(yǎng)微生物菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析進(jìn)行鑒定并繪制生長(zhǎng)曲線。同時(shí)測(cè)定乳酸鏈球菌素（Nisin）等7種肉制品中常用防腐劑對(duì)分離得到的腐敗菌株的抑制效果，旨在為中溫醬牛肉腐敗微生物的有效控制提供依據(jù)，也為其他中溫醬鹵類肉制品的防腐保鮮和貨架期的延長(zhǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛后腿肉：五豐福成食品有限公司；食鹽、白砂糖、香辛料等：中國(guó)肉類食品綜合研究中心香辛料部；蔥、姜：市售；高溫蒸煮袋：北京萬(wàn)華鋁塑包裝有限公司。

平板計(jì)數(shù)瓊脂（platecountagar，PCA）培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

Nisin、亞硝酸鈉、乳酸鈉（食品級(jí)）：北京迪朗生化科技有限公司；山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉（食品級(jí)）：南通奧凱生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（食品級(jí)）：安徽省興宙醫(yī)藥食品有限公司；雙乙酸鈉（食品級(jí)）：連云港信仁食品添加劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCRMasterMix：天根生化科技有限公司；DNA Marker、溶菌酶：寶生物工程（大連）有限公司；通用引物27F（5′-AGA GTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTA CCTTGTTACGACTT-3′）：由上海立菲生物技術(shù)有限公司（北京）合成。

1.2 儀器與設(shè)備

700-1000型殺菌釜：山東諸城中泰機(jī)械有限公司；BSA822-CW型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；F1-45型恒溫培養(yǎng)箱、G154DWS濕熱滅菌鍋：日本三洋公司；BSC-1000二級(jí)生物安全柜：新加坡Esco公司；SCIENTZ-11L型無(wú)菌均質(zhì)器：浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀、Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；蔡司ZEISS primo star生物顯微鏡：北京普瑞賽司儀器有限公司；VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀及配套芽孢桿菌鑒定卡（BCL卡片）：北京威泰科生物技術(shù)有限公司；Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀：上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中溫醬牛肉加工工藝流程

原料肉→解凍→分割修整→滾揉腌制→焯水→煮制→冷卻→真空包裝→中溫殺菌（100℃、20 min）→成品（約200 g/包）

1.3.2 腐敗菌的分離與純化

真空包裝中溫醬牛肉成品于室溫（25℃）貯藏，每隔2 d取樣測(cè)定產(chǎn)品菌落總數(shù)，每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行。貯藏過(guò)程中測(cè)定產(chǎn)品菌落總數(shù)：無(wú)菌條件下隨機(jī)從醬牛肉不同部位取樣25 g，剪碎，放入無(wú)菌均質(zhì)袋中，再加入225 mL無(wú)菌生理鹽水，用無(wú)菌均質(zhì)器拍打均質(zhì)，梯度稀釋后，采用PCA培養(yǎng)基對(duì)中溫醬牛肉貯藏過(guò)程中的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。當(dāng)菌落總數(shù)超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2726—2005《熟肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[23]規(guī)定的8×104CFU/g時(shí)，停止計(jì)數(shù)。從貯藏過(guò)程中PCA平板上挑取典型生長(zhǎng)的菌落并反復(fù)劃線純化，獲得單菌株并進(jìn)行菌種保藏[24]。

1.3.3 腐敗菌的菌種鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察和革蘭氏染色

將已純化的菌株接種至PCA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h后觀察其菌落形狀、色澤、隆起度等特征，革蘭氏染色并鏡檢觀察菌體形態(tài)。挑取、轉(zhuǎn)接單菌落于PCA平板上，37℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)一步利用相差顯微鏡觀察菌株是否產(chǎn)生芽孢。

（2）生理生化鑒定

用無(wú)菌棉簽蘸取平板上純菌落，制備1.8～2.2麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙?，用全自?dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定。

（3）分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和片段大小。采用通用引物27F和1492R，以基因組DNA為模板擴(kuò)增16SrRNA序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）反應(yīng)體系（50 μL）：DNA模板2 μL，引物27F和1492R各1μL，2×TaqPCRMasterMix25μL，重蒸水21μL；PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后，送至英濰捷基（北京）貿(mào)易有限公司測(cè)序，應(yīng)用BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果在GenBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較以鑒定菌種歸屬。

（4）防腐劑對(duì)主要腐敗菌的抑制實(shí)驗(yàn)

防腐劑配制：稱取相應(yīng)質(zhì)量的7種防腐劑（精確到0.001 g），加無(wú)菌生理鹽水充分溶解，再用0.45 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。所配制的7種防腐劑的質(zhì)量濃度參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[25]中規(guī)定的各自在醬牛肉中的最大添加量及實(shí)際生產(chǎn)使用情況，防腐劑名稱和具體添加量見(jiàn)表1。

表1 7種防腐劑質(zhì)量濃度Table 1 Concentration of seven preservatives

管碟法[26]：將所篩選的腐敗菌菌株接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，搖床培養(yǎng)18～24 h，得到濃度為108～109CFU/mL的菌懸液，滅菌后的PCA培養(yǎng)基冷卻至45℃左右，在每100 mL上述培養(yǎng)基中添加2 mL活化好的菌懸液，充分混合均勻后倒入平板。待凝固后，以無(wú)菌操作在培養(yǎng)基表面垂直、均勻地放置牛津杯（直徑8.00 mm），取200 μL防腐劑溶液分別加入牛津杯中，以無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照，37℃培養(yǎng)24 h后，移去牛津杯觀察并測(cè)量抑菌圈直徑d（mm）。每組3個(gè)平行，取平均值，抑菌圈大小X（mm）計(jì)算公式為：X=d-8.00

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗細(xì)菌的分離與形態(tài)學(xué)特征

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2726—2005《熟肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[23]規(guī)定，醬鹵類肉制品銷售前的菌落總數(shù)需≤8×104CFU/g，真空包裝中溫醬牛肉在25℃貯藏37 d時(shí)，菌落總數(shù)超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在此過(guò)程中，從PCA培養(yǎng)基上共分離挑取特征菌落9個(gè)，編號(hào)依次為N100-1～N100-9。革蘭氏染色鏡檢后發(fā)現(xiàn)這9株菌均為革蘭氏陽(yáng)性桿菌且生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生芽孢。各菌株的菌落形態(tài)觀察結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 9株腐敗菌菌落特征Table 2 Colony characteristics of nine spoilage bacteria strains

2.2 腐敗細(xì)菌的生理生化鑒定

根據(jù)9株腐敗細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，選取BCL鑒定卡，利用全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，菌株N100-1、N100-3和N100-9初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens），菌株N100-4為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），其余5株菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）或死谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）。根據(jù)VITEK 2 Compact產(chǎn)品信息說(shuō)明，由于枯草芽孢桿菌和死谷芽孢桿菌生化譜基本一致，且解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌屬于相似菌群，因此需要利用分子生物學(xué)手段進(jìn)一步區(qū)分及驗(yàn)證。

表3 9株腐敗菌的生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of nine spoilage bacteria strains by physiological and biochemical experiments

續(xù)表

2.3 分子生物學(xué)鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

經(jīng)測(cè)序，9株細(xì)菌的16SrRNA基因序列大小約為1500bp，均符合細(xì)菌16S rRNA序列長(zhǎng)度。將各菌株序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA5.0軟件分析其與芽孢桿菌屬內(nèi)相關(guān)種的同源性，一般認(rèn)為，同源性＞99%則屬于同一種[27]。同時(shí)，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，明確9株細(xì)菌之間及與相關(guān)芽孢桿菌種之間的親緣關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 基于16S rRNA基因序列同源性的9株腐敗菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of nine spoilage bacteria strains based on homology of 16S rRNA gene sequence

經(jīng)生理生化鑒定和分子生物學(xué)分析可知，菌株N100-2、N100-5、N100-6、N100-7、N100-8鑒定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis）；菌株N100-1、N100-3、N100-9鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）；菌株N100-4鑒定為蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）。

從真空包裝中溫醬牛肉25℃貯藏過(guò)程中分離的9株腐敗菌均屬于芽孢桿菌屬，這主要與殺菌工藝與貯藏溫度有關(guān)。低溫肉制品中一些腐敗菌如腸桿菌、假單胞菌和熱死環(huán)絲菌耐熱性差，可能在100℃的二次殺菌過(guò)程中被殺滅，且室溫貯存有利于芽孢桿菌的迅速增殖[17]。

2.4 管碟法檢測(cè)防腐劑對(duì)9株腐敗菌的抑制作用

由表4可知，7種防腐劑對(duì)9株腐敗菌的抑制效果有所差異，其中乳酸鈉、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、雙乙酸鈉和Nisin這4種防腐劑對(duì)9株腐敗菌具有普遍較好的抑制效果。而山梨酸鉀除對(duì)菌株N100-4具有一定抑制作用外，對(duì)其余8株腐敗菌抑制作用極弱或未表現(xiàn)出抑菌效果。亞硝酸鈉對(duì)菌株N100-5沒(méi)有抑菌作用，對(duì)另外8株腐敗菌只有微弱的抑菌效果。脫氫乙酸鈉對(duì)菌株N100-2和N100-4表現(xiàn)出良好的抑制效果，但對(duì)其他菌株抑制作用微弱。比較發(fā)現(xiàn)，同種防腐劑對(duì)不同種屬的細(xì)菌抑菌效果不同，而且對(duì)同種細(xì)菌的不同菌株之間抑菌效果也存在一定差異。

表4 管碟法測(cè)定7種防腐劑對(duì)9株腐敗菌的抑制效果Table 4 Inhibitory effect of seven preservatives on nine spoilage bacteria strains by cylinder-plate method

葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯屬于新型多功能的食品添加劑，其抑菌機(jī)理主要表現(xiàn)在溶于水后分解釋放出一種酸性物質(zhì)—葡萄糖酸[28]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)中溫醬牛肉中分離出的9株腐敗菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性，可見(jiàn)將其應(yīng)用于中溫肉制品防腐保鮮領(lǐng)域具有廣闊的前景。Nisin是一種應(yīng)用非常廣泛的生物防腐劑，具有使用劑量低，抑菌效果好的特點(diǎn)[29]，實(shí)驗(yàn)中，Nisin對(duì)9株芽孢桿菌具有較明顯的抑菌效果，這與文獻(xiàn)[26]中報(bào)道的結(jié)果一致。山梨酸鉀主要對(duì)霉菌、酵母等發(fā)揮抑制作用，具有一定的局限性，適宜與其他防腐劑復(fù)配使用[29]。

3 結(jié)論

本研究從真空包裝中溫醬牛肉常溫（25℃）貯藏過(guò)程中分離得到9株特異性菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析和分子生物學(xué)鑒定，確定其由5株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、3株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和1株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）組成。管碟法抑菌實(shí)驗(yàn)表明，乳酸鈉、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、雙乙酸鈉和Nisin這4種防腐劑對(duì)9株腐敗菌具有普遍較好的抑制效果，而山梨酸鉀、亞硝酸鈉和脫氫乙酸鈉抑菌效果相對(duì)較差，且具有一定局限性。

微生物生長(zhǎng)繁殖是影響中溫肉制品貨架期的決定性因素，本研究從真空包裝醬牛肉中分離到的微生物菌株會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品菌落總數(shù)超標(biāo)，但有關(guān)這些微生物菌株的致腐能力、中溫醬牛肉腐敗菌的組成和腐敗過(guò)程中產(chǎn)品感官和食用品質(zhì)變化等研究還有待進(jìn)一步開(kāi)展。針對(duì)中溫醬牛肉中芽孢桿菌為主要腐敗菌的特點(diǎn)，開(kāi)展芽孢快速誘導(dǎo)萌發(fā)殺滅技術(shù)研究，將進(jìn)一步為中溫肉制品的防腐保鮮提供有價(jià)值的指導(dǎo)。

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Isolation and identification of spoilage bacteria from sauced beef sterilized at medium-temperature and effect of preservatives on inhibition of the bacteria

PANXiaoqian1,ZHANGShunliang1,LISu1,ZHAOWanjing2,QIAOXiaoling1,CHENWenhua1,LIJiapeng1,QUChao1,ZHAOYan1*
(1.Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology,China Meat Research Center,Beijing 100068,China; 2.College of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

Spoilage bacteria were isolated and identified from vacuum-packaged sauced beef sterilized at medium-temperature and stored at 25℃.The bacteriostatic efficacy of seven common preservatives in meat products on these strains was analyzed by cylinder-plate method.Results indicated that nine strains with different colonial morphology were isolated from the plates,and identified as fiveBacillus subtilisstrains,threeBacillus amyloliquefaciensstrains and oneBacillus cereusstrain by morphological observation,physiological and biochemical tests and 16S rRNA gene sequence.Sodium lactate,glucono-δ-lactone,sodium diacetate and Nisin generally had obvious bacteriostatic activity on these nine spoilage bacteria strains,but the bacteriostatic effect of potassium sorbate,sodium nitrite and sodium dehydroacetate was relatively poor.

medium-temperature sterilization;sauced beef;spoilage bacteria;isolation and identification;preservative

TS251.1

0254-5071（2017）03-0024-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.006

2016-12-01

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD28B01）

潘曉倩（1987-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與肉制品質(zhì)量安全。

*通訊作者：趙燕（1973-），女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称芳庸べ|(zhì)量安全控制和清潔生產(chǎn)與節(jié)能減排。