王丕明，冉旺旺，譚柏清，羅維曉（.武警山東省總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 5004；.山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，濟(jì)南 5000）

尼美舒利聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)食管癌模型大鼠微血管密度及免疫功能的影響

王丕明1＊，冉旺旺1，譚柏清2#，羅維曉2（1.武警山東省總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，濟(jì)南 250014；2.山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，濟(jì)南 250200）

目的：研究尼美舒利聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)食管癌模型大鼠微血管密度及免疫功能的影響。方法：取48只大鼠建立食管癌模型后隨機(jī)分為模型組、奧沙利鉑組、尼美舒利組和聯(lián)用組，每組12只。建模后1 d，模型組大鼠尾iv 5%的葡萄糖注射液1 mL，每周3次，ig等量羧甲基纖維素鈉溶液，每周1次；奧沙利鉑組大鼠尾iv奧沙利鉑13.6 mg/kg，每周3次；尼美舒利組大鼠ig尼美舒利20 mg/kg，每周1次；聯(lián)用組大鼠同法給予奧沙利鉑和尼美舒利，給藥時(shí)間為8周。觀察各組大鼠腫瘤生長情況、腫瘤組織微血管密度、外周血免疫功能指標(biāo)。結(jié)果：與模型組比較，各給藥組大鼠腫瘤體積、瘤質(zhì)量、腫瘤組織的積分吸光度和陽性血管密度均降低（P＜0.05）；奧沙利鉑組和聯(lián)用組大鼠外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值均降低，CD8+T細(xì)胞數(shù)均增加（P＜0.05）。與尼美舒利組比較，奧沙利鉑組和聯(lián)用組大鼠腫瘤體積、瘤質(zhì)量、腫瘤組織的積分吸光度和陽性血管密度，以及外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值均降低，抑瘤率和CD8+T細(xì)胞數(shù)均增加（P＜0.05），其中聯(lián)用組較奧沙利鉑組更明顯（P＜0.05）。結(jié)論：奧沙利鉑聯(lián)合尼美舒利能夠更有效地抑制食管癌的生長，其機(jī)制可能與抑制腫瘤組織中血管新生、增強(qiáng)免疫有關(guān)。

食管癌；大鼠；尼美舒利；奧沙利鉑；微血管密度；免疫功能

食管癌是預(yù)后較差的消化道惡性腫瘤，臨床上早期診斷食管癌較為困難，確診時(shí)多為進(jìn)展期，部分患者通過手術(shù)切除后仍需繼續(xù)接受化療，而晚期患者則失去手術(shù)時(shí)機(jī)，僅能通過化療來延長生存時(shí)間[1]。鉑類化療藥物是細(xì)胞周期非特異性的化療藥物，對(duì)細(xì)胞具有殺傷作用，被廣泛用于消化道惡性腫瘤的治療。但是，癌細(xì)胞在化療過程中會(huì)產(chǎn)生耐藥性而影響化療效果[2]。近年來，環(huán)氧合酶2（COX-2）與惡性腫瘤的關(guān)系受到了越來越多的重視，COX-2過表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移。尼美舒利是選擇性COX-2抑制劑，對(duì)COX-2的活性具有顯著抑制作用[3]。筆者將尼美舒利和奧沙利鉑聯(lián)用，研究其對(duì)人食管癌模型大鼠微血管密度及免疫功能的影響，以期為臨床食管癌的治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7600型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；Cyto-FLEX型流式細(xì)胞分析儀和Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫光特公司）；HPIAS-1000型高彩色病理圖像分析系統(tǒng)由同濟(jì)大學(xué)提供。

1.2 藥品與試劑

尼美舒利片（廣東惠德勤藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H19980132，規(guī)格：每片0.1 g）；注射用奧沙利鉑（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，批號(hào)：J20100064，規(guī)格：每瓶50 mg）；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（南京建成生物公司）；流式細(xì)胞術(shù)試劑盒（美國BD公司）。

1.3 細(xì)胞及其培養(yǎng)基

人食管癌Eca109細(xì)胞購買于AGTT細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)基和血清購買于美國Thermo公司。

1.4 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠48只，周齡6～8周，體質(zhì)量160～220 g，購于山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXK（魯）20151205，飼養(yǎng)于溫度20～25℃、濕度40%～60%條件下。本次研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 食管癌移植瘤模型的建立

參照文獻(xiàn)[4]，采用皮下接種人食管癌細(xì)胞建立食管癌模型大鼠。培養(yǎng)Eca109細(xì)胞，胰蛋白酶常規(guī)消化傳代，取傳代擴(kuò)增且處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行消化，離心收集細(xì)胞后用D'Hanks溶液重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1× 107mL－1。在大鼠右側(cè)前肢的腋下注射0.5 mL細(xì)胞懸液，取成瘤大鼠（腫瘤體積約為100 mm3）用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組與給藥

將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、奧沙利鉑組、尼美舒利組和聯(lián)用組，每組12只。建模后1 d，模型組大鼠尾iv 5%的葡萄糖注射液1 mL，每周3次，ig等量羧甲基纖維素鈉溶液，每周1次；奧沙利鉑組大鼠尾iv奧沙利鉑13.6 mg/kg，每周3次，奧沙利鉑用5%的葡萄糖注射液溶解；尼美舒利組大鼠ig尼美舒利20 mg/kg，每周1次，尼美舒利用羧甲基纖維素鈉溶液溶解；聯(lián)用組大鼠同法給予奧沙利鉑和尼美舒利。給藥時(shí)間為8周。

2.3 標(biāo)本采集

給藥8周后，頸椎脫臼法處死大鼠，眼球取血用于免疫功能檢測(cè)；解剖得到腫瘤組織并用生理鹽水清洗，每只大鼠的腫瘤組織分為兩份，一份用4%福爾馬林固定后石蠟包埋、制作石蠟切片，另一份用液氮冷凍后保存在－80℃冰箱待用。

2.4 腫瘤生長情況考察

用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤長徑（a）、短徑（b），計(jì)算移植瘤體積（V＝ab2π/6）；稱取瘤體質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率[（模型組瘤質(zhì)量－給藥組瘤質(zhì)量）/模型組瘤質(zhì)量×100%]。

2.5 腫瘤組織微血管密度測(cè)定

參照文獻(xiàn)[5]，取食管癌移植瘤組織標(biāo)本，用多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、染色（染色蛋白為CD31），在100倍顯微鏡下，采集3～5個(gè)陽性細(xì)胞較多的區(qū)域，輸入高彩色病理圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算積分吸光度、面密度陽性率。積分吸光度＝陽性面密度×積分光度；面密度陽性率＝陽性目標(biāo)面密度/（陽性目標(biāo)面密度+陰性目標(biāo)面密度）×100%。

2.6 免疫功能考察

處死大鼠后眼球取血2 mL，分別與CD3、CD4、CD8的熒光標(biāo)記單克隆抗體共同孵育后，在流式細(xì)胞儀上測(cè)定CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)，計(jì)算CD4+/CD8+比值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 腫瘤生長情況

與模型組比較，各給藥組大鼠腫瘤體積、瘤質(zhì)量均降低（P＜0.05）；與尼美舒利組比較，奧沙利鉑組和聯(lián)用組大鼠腫瘤體積、瘤質(zhì)量均降低，抑瘤率均升高（P＜0.05），其中聯(lián)用組較奧沙利鉑組差異更明顯（P＜0.05）。各組大鼠腫瘤生長情況見表1。

表1 各組大鼠腫瘤生長情況（±s，n＝12）Tab 1 Situation of cancer growth in rats of each group（±s，n＝12）

表1 各組大鼠腫瘤生長情況（±s，n＝12）Tab 1 Situation of cancer growth in rats of each group（±s，n＝12）

注：與模型組比較，＊P＜0.05；與尼美舒利組比較，#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，ΔP＜0.05Note：vs.model group，＊P＜0.05；vs.nimesulide group，#P＜0.05；vs.oxaliplatin group，ΔP＜0.05

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3.2 腫瘤組織微血管密度

與模型組比較，各給藥組大鼠腫瘤組織的積分吸光度、面密度陽性率均降低（P＜0.05）；與尼美舒利組比較，奧沙利鉑組和聯(lián)用組大鼠積分吸光度、面密度陽性率均降低（P＜0.05），其中聯(lián)用組較奧沙利鉑組差異更明顯（P＜0.05）。各組大鼠積分吸光度和面密度陽性率的測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠積分吸光度和面密度陽性率的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2 Determination results of integral absorbance and positive rate of surface density in rats of each group（±s，n＝12）

表2 各組大鼠積分吸光度和面密度陽性率的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2 Determination results of integral absorbance and positive rate of surface density in rats of each group（±s，n＝12）

注：與模型組比較，＊P＜0.05；與尼美舒利組比較，#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，ΔP＜0.05Note：vs.model group，＊P＜0.05；vs.nimesulide group，#P＜0.05；vs.oxaliplatin group，ΔP＜0.05

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3.3 免疫功能

與模型組和尼美舒利組比較，奧沙利鉑組、聯(lián)用組大鼠外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值均降低，CD8+T細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05），其中聯(lián)用組效果較奧沙利鉑組更明顯（P＜0.05）。各組大鼠免疫功能的測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠免疫功能的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 3 Determination results of immune function of rats in each group（±s，n＝12）

表3 各組大鼠免疫功能的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 3 Determination results of immune function of rats in each group（±s，n＝12）

注：與模型組比較，＊P＜0.05；與尼美舒利組比較，#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，ΔP＜0.05Note：vs.model group，＊P＜0.05；vs.nimesulide group，#P＜0.05；vs.oxaliplatin group，ΔP＜0.05

?

4 討論

食管癌患者在診斷時(shí)多數(shù)已發(fā)展至中晚期，常采用聯(lián)合化療來抑制病情發(fā)展。奧沙利鉑為第三代鉑類藥物，具有廣譜的抗癌活性，且毒性比順鉑、卡鉑小，是治療食管癌理想的化療藥物，但單獨(dú)使用效果不甚理想[6]。近年來，越來越多的研究證實(shí)COX-2能夠促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也有研究證實(shí)COX-2選擇性地抑制劑尼美舒利能夠抑制食管癌細(xì)胞的增殖[7]。由此筆者推測(cè)，使用尼美舒利能夠抑制食管癌的發(fā)展。本研究中，各給藥組大鼠腫瘤體積明顯低于模型組，且聯(lián)用組效果最明顯，與國內(nèi)外報(bào)道[8-9]一致，提示尼美舒利聯(lián)合奧沙利鉑有助于抑制腫瘤的生長，這也可以從瘤質(zhì)量與抑瘤率的比較中得到證實(shí)。

血管新生是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，腫瘤組織局部新生的血管能夠?yàn)榧?xì)胞的生長提供必需的養(yǎng)分，同時(shí)也能夠?yàn)榧?xì)胞的轉(zhuǎn)移提供通路[10]。微血管密度是評(píng)估腫瘤血管生成狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可反映腫瘤組織的血流灌注情況[11]。腫瘤生成血管數(shù)目越多，腫瘤能夠獲得的營養(yǎng)、供養(yǎng)就越豐富，發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的幾率就越高[12]。研究表明，微血管密度與食管鱗癌的浸潤與轉(zhuǎn)移相關(guān)，惡性腫瘤組織中微血管密度均異常升高[13]。COX-2所催化產(chǎn)生的前列腺素E2（PGE2）具有促進(jìn)血管新生的作用，而尼美舒利則能夠通過選擇性抑制COX-2來拮抗血管新生過程。本文研究中，聯(lián)用組大鼠積分吸光度、陽性血管面密度明顯低于尼美舒利組、奧沙利鉑組，提示尼美舒利聯(lián)合奧沙利鉑有助于抑制食管癌組織中血管新生。

化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)機(jī)體正常的組織造成損傷，免疫功能破壞是化療過程中常見的不良反應(yīng)[14]。CD3是成熟T細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD4和CD8則分別是輔助性和抑制性T細(xì)胞的表面標(biāo)志[15]。CD4/CD8更能反映機(jī)體免疫狀態(tài)，一旦動(dòng)態(tài)平衡被打破，就提示機(jī)體免疫功能受到損傷。本研究中，奧沙利鉑組、聯(lián)用組大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明顯低于模型組，CD8+明顯高于模型組，說明奧沙利鉑單用以及聯(lián)合尼美舒利均會(huì)造成免疫功能損傷。尼美舒利組、聯(lián)用組大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+明顯高于奧沙利鉑組，CD8+明顯低于奧沙利鉑組，提示在奧沙利鉑化療的基礎(chǔ)上給予尼美舒利能夠減輕化療藥物所引起的免疫功能損傷。

本研究結(jié)果表明，奧沙利鉑聯(lián)合尼美舒利有助于抑制食管癌腫瘤生長，其機(jī)制可能與改善免疫功能、抑制血管新生有關(guān)。本研究的局限性在于觀察指標(biāo)較少，未對(duì)血清腫瘤標(biāo)志物等其他指標(biāo)進(jìn)行比較，但是本文僅僅是一個(gè)實(shí)驗(yàn)性研究，尼美舒利、奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用于臨床還有待于進(jìn)一步的探索。

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（編輯：鄒麗娟）

Effects of Nimesulide Combined with Oxaliplatin on Microvessel Density and Immune Function of Esophageal Cancer Model Rats

WANG Piming1，RAN Wangwang1，TAN Baiqing2，LUO Weixiao2（1.Clinical Laboratory，Armed Police Shandong Corps Hospital，Jinan 250014，China；2.Shandong Biobase Bio-industrial Co.，Ltd.，Jinan 250200，China）

OBJECTIVE：To study the effects of nimesulide combined with oxaliplatin on microvessel density and immune function of esophageal cancer model rats.METHODS：48 rats were selected to establish esophageal cancer model and then randomly divided into model group，oxaliplatin group，nimesulide group and combination group，with 12 rats in each group.1 d after modeling，model group was given 5%Glucose injection 1 mL via tail vein，3 times a week，and constant volume of Sodium carboxymethylcellulose solution，once a week.Oxaliplatin group was given oxaliplatin 13.6 mg/kg via tail vein，3 times a week.Nimesulide group was given nimesulide 20 mg/kg intragastrically，once a week.Combination group was given oxaliplatin and nimesulide with same usage as above.The administration lasted for 8 weeks.The cancer growth，microvessel density of cancer tissue，peripheral blood immune function index were observed in four groups.RESULTS：Compared with model group，cancer size，cancer weight，integral absorbance of cancer and positive vessel density were all decreased in treatment groups（P＜0.05）.The number of peripheral blood CD3+，CD4+T cells and CD4+/CD8+were all decreased in oxaliplatin group and combination group，while the number of CD8+T cells was decreased（P＜0.05）.Compared with nimesulide group，cancer size，cancer weight，integral absorbance of cancer，positive vessel density，the number of peripheral blood CD3+，CD4+T cells and CD4+/CD8+were all decreased in oxaliplatin group and combination group，while tumor inhibition rate and the number of CD8+T cells were all increased（P＜0.05）；combination group was more significant than oxaliplatin group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Oxaliplatin combined with nimesulide can effectively inhibit cancer growth of esophageal cancer，the mechanism of which may be associated with inhibiting angiogenesis of tumor tissue and strengthening immune function.

Esophageal cancer；Rat；Nimesulide；Oxaliplatin；Microvessel density；Immune function

R965

A

1001-0408（2017）04-0505-04

2016-06-21

2016-10-24）

＊主管技師。研究方向：免疫醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。電話：0531-67965811。E-mail：wpmearth@163.com

#通信作者：高級(jí)工程師，碩士。研究方向：體外診斷試劑。電話：0531-58626068。E-mail：tbq.@biobase.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.20