唐進(jìn)法，張帆，李宇輝，吳宿慧，李寒冰，李偉霞，李學(xué)林#（.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000；.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450000）

何首烏乙酸乙酯提取物對秀麗線蟲的抗衰老作用研究Δ

唐進(jìn)法1＊，張帆2，李宇輝2，吳宿慧2，李寒冰2，李偉霞1，李學(xué)林1#（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450000）

目的：研究何首烏乙酸乙酯提取物（EPM）對秀麗線蟲（簡稱“線蟲”）壽命的影響，考察EPM抗衰老作用。方法：設(shè)立EPM低、中、高濃度組（25、37.5、50 mg/L，以生藥計）和空白組（0 mg/L），考察EPM對線蟲壽命的影響；設(shè)立EPM組（37.5 mg/L）和空白組（0 mg/L），分別進(jìn)行線蟲的生殖實驗、急性熱應(yīng)激實驗和急性氧化應(yīng)激實驗，考察EPM對線蟲生殖能力以及壓力應(yīng)激的影響。結(jié)果：在壽命實驗中，EPM低、中、高濃度組線蟲的平均壽命較空白組均顯著延長（P＜0.05或P＜0.01），以中濃度EPM作用最為明顯；增殖實驗中，EPM組線蟲在第2、3天中的子代數(shù)量較空白組顯著增加（P＜0.05）；在急性熱應(yīng)激實驗和急性氧化應(yīng)激實驗中，EPM組線蟲的平均生存時間較空白組明顯延長（P＜0.05）。結(jié)論：37.5 mg/L的EPM能延緩線蟲衰老且不損害其生殖能力。

何首烏；乙酸乙酯提取物；抗衰老；秀麗線蟲；壽命；氧化應(yīng)激；熱應(yīng)激

何首烏為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorumThunb.）的干燥塊根，味苦、甘、澀，性微溫，炮制后具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)等作用?！侗静菥V目》載：“何首烏……久用長筋骨、益精髓、延年不老……”[1]。現(xiàn)代藥學(xué)研究表明，制首烏主要含有二苯乙烯苷類、磷脂等成分，具有抗衰老、調(diào)節(jié)血脂等功效，是我國傳統(tǒng)的抗衰老中藥[2-3]。目前，何首烏抗衰老的作用及其機制研究多以小鼠、果蠅、鶴鶉等[4-5]作為動物模型，但因培養(yǎng)條件高、壽命周期長、研究成本高、近親繁殖等因素限制了對其更深入的研究。

有研究表明，daf-2突變體的壽命是正常壽命的2倍，這標(biāo)志著秀麗線蟲正式進(jìn)入衰老研究領(lǐng)域[6]。因其具有易飼養(yǎng)、自我繁殖力強、與人類的同源性基因數(shù)量多等優(yōu)點，使其逐漸成為國際上公認(rèn)的研究抗衰老的模式生物，有望替代小鼠等動物模型成為中藥抗衰老研究的首選模型[7-10]。本研究以野生秀麗線蟲（株系N2）的存活時間、生殖能力和急性熱、氧化應(yīng)激能力等作為指標(biāo)，研究何首烏乙酸乙酯提取物（Ethyl acetate extract fromP.multiflora，EPM）的抗衰老作用，為進(jìn)一步研究其抗衰老機制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SMZ-140臺式顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）。

1.2 藥材與試劑

何首烏采自廣州石鼓鎮(zhèn)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定為正品；氯仿、乙酸乙酯和二甲基亞砜等試劑均為分析純。

1.3 菌株與線蟲

大腸埃希菌（OP50）和野生秀麗線蟲（N2）均由北京生命科學(xué)院董夢秋實驗室惠贈。

2 方法

2.1 藥材的處理

2.1.1 藥材的炮制 取適量何首烏，用80%黑豆汁拌勻悶潤約8 h，高壓清蒸6 h，然后將樣品置于采光好的地方，放置1天1夜使其干透，此為一蒸一曬。反復(fù)9次蒸、曬即得[11]。

2.1.2 藥液的制備 取283 g上述何首烏炮制品，加10倍量水提取，將水提液濃縮至168 mL后，取84 mL濃縮液，依次用等體積氯仿萃取5次，收集萃取液。取上層萃取液，用等體積乙酸乙酯萃取9次，收集萃取液并置于水浴鍋中揮干溶劑，即得EPM。取適量EPM，由二甲基亞砜（濃度＜1%）助溶于超純水中，制備成質(zhì)量濃度分別為25、37.5、50 mg/L的EPM藥液。

2.2 線蟲的培養(yǎng)

將線蟲接種于涂布有大腸埃希菌的NGM（Nematode growth media）培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基置于20℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察線蟲的生長情況并定期更換培養(yǎng)基[12]。挑選表面光滑、無氣泡、無劃痕的培養(yǎng)基進(jìn)行接種。

2.3 線蟲的壽命實驗

實驗設(shè)置EPM低、中、高濃度組（25、37.5、50 mg/L，以生藥計）和空白組（0 mg/L）。參考文獻(xiàn)[13]中方法，每個組分別挑取2～3條生殖期線蟲進(jìn)行實驗，當(dāng)線蟲產(chǎn)卵1 h后均放入20℃生化培養(yǎng)箱中；待發(fā)育至第四階段幼蟲期（即L4期）后，轉(zhuǎn)入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)皿中。每組線蟲數(shù)量均為20條，此時記為壽命實驗第0天。每天觀察并記錄線蟲生存、死亡及剔除的數(shù)量（在壽命實驗期間，發(fā)現(xiàn)線蟲對外界刺激沒有應(yīng)答時視為死亡；剔除逃離培養(yǎng)基表面而干死、蟲卵在體內(nèi)孵化而成袋樣蟲或者鉆進(jìn)培養(yǎng)基內(nèi)部的線蟲[14]）。

2.4 線蟲的生殖實驗

每組分別挑選10條L4期線蟲（同壽命實驗），單獨每條轉(zhuǎn)至標(biāo)記的空白組（0 mg/L）和EPM組（37.5 mg/L）中，此時記為生殖實驗第1天。以后每24 h移至相應(yīng)的培養(yǎng)基中直至線蟲生殖能力喪失。將線蟲轉(zhuǎn)移前的培養(yǎng)基置于20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計算子代數(shù)量（即產(chǎn)卵數(shù)量）[15]。

2.5 線蟲的急性熱應(yīng)激實驗

[16]中方法，將線蟲分別置于空白組（0 mg/L）和EPM組（37.5 mg/L）的培養(yǎng)基中產(chǎn)卵0.5 h；將受精卵在20℃條件下孵育58 h后，在35℃條件下進(jìn)行熱應(yīng)激實驗。每隔1 h記錄1次每組線蟲死亡以及存活的數(shù)量（線蟲死亡的判定標(biāo)準(zhǔn)同壽命實驗）。

2.6 線蟲的急性氧化應(yīng)激實驗

參考文獻(xiàn)[17]方法，將線蟲置于空白組（0 mg/L）或EPM組（37.5 mg/L）的培養(yǎng)基中產(chǎn)卵0.5 h；將受精卵在20℃下孵育58 h后，將線蟲分別置于標(biāo)記好的含有0.4 mmol/L雙氧水（H2O2）的96孔板中，每個孔內(nèi)放置5條線蟲，每0.5 h記錄1次線蟲死亡以及存活的數(shù)量（線蟲死亡的判定標(biāo)準(zhǔn)同壽命實驗）。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 壽命實驗結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的EPM均能使線蟲的生命曲線右移（詳見圖1），均能延長線蟲的壽命。空白組和EPM低、中、高濃度組線蟲的平均壽命分別為（17.50±6.88）、（22.40±8.16）、（23.50±7.42）、（22.97±7.86）d。這提示EPM低、中、高濃度組線蟲的平均壽命與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且以EPM質(zhì)量濃度為37.5 mg/L時延長壽命效果最好。因此用該質(zhì)量濃度作為其他生理指標(biāo)的實驗濃度。

圖1 不同質(zhì)量濃度EPM作用后秀麗線蟲的生命曲線Fig 1 Life curves of caenorhabditis elegans after different concentrations of EPM

3.2 生殖實驗結(jié)果

EPM組和空白組線蟲均為培養(yǎng)第2天的子代數(shù)量最多，之后呈下降趨勢。其中培養(yǎng)第2、3天后EPM組的子代數(shù)量均顯著多于空白組（P＜0.05）；在總子代數(shù)量上，EPM組多于空白組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），結(jié)果詳見表1。

3.3 急性熱應(yīng)激實驗結(jié)果

EPM能顯著增強線蟲的耐熱能力，延長線蟲在35℃條件下的平均存活時間。與空白組線蟲的平均存活時間[（16.23±1.65）d]比較，EPM組線蟲的平均存活時間（[17.83±1.45）d]顯著延長（P＜0.05）。

3.4 急性氧化應(yīng)激實驗結(jié)果

EPM能顯著提高線蟲的抗氧化能力，延長線蟲在0.4 mmol/L H2O2中的平均存活時間。與空白組線蟲的平均存活時間[（5.810±1.800）d]比較，EPM組線蟲的平均存活時間[（7.287±2.030）d]顯著延長（P＜0.05）。

表1 各組線蟲子代數(shù)量測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 The number of offspring of caenorhabditis elegans in each group（±s，n＝10）

表1 各組線蟲子代數(shù)量測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 The number of offspring of caenorhabditis elegans in each group（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＊P＜0.05Note：vs.blank group，＊P＜0.05

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4 討論

線蟲同期化即將所需的線蟲控制在同一發(fā)育期，這將有利于對其表征進(jìn)行對比實驗，故在測定各項指標(biāo)前需要對線蟲進(jìn)行同期化處理。當(dāng)所需同期化線蟲少時，可采用限時產(chǎn)卵法進(jìn)行處理[13]；反之，可采用高氯酸鈉漂白法[9]進(jìn)行處理。飲食限制即對線蟲進(jìn)行熱量限制，是延長線蟲壽命的一種方法。因此，在進(jìn)行壽命實驗前應(yīng)考慮EPM是否具有抑制大腸埃希菌的作用，設(shè)定藥液的質(zhì)量濃度應(yīng)低于藥物對大腸埃希菌最小抑制濃度（MIC）[18]。筆者在前期抑菌試驗中發(fā)現(xiàn)，EPM對大腸埃希菌的MIC為60 mg/L，且自該質(zhì)量濃度起對線蟲開始出現(xiàn)毒害作用，個別線蟲的受精卵聚于陰戶，形成異形蟲。因此，在本研究壽命實驗中設(shè)置EPM質(zhì)量濃度分別為25、37.5、50 mg/L。

常見的線蟲給藥方式有以下兩種：（1）在配制NGM培養(yǎng)基時添加所需質(zhì)量濃度的藥液，再經(jīng)過滅菌分裝即可[19]；（2）先配制好所需不同質(zhì)量濃度的藥液，然后將各質(zhì)量濃度藥液直接滴加至涂布有大腸埃希菌的NGM培養(yǎng)基中[14]。然而值得考慮的是，在第一種方法中藥物有效成分的含量以及藥效是否會受到滅菌操作的影響；第二種方法中線蟲是否有可能進(jìn)食不含藥液的大腸埃希菌。綜合以上考慮，在本研究中筆者先將一定量大腸埃希菌和不同質(zhì)量濃度的藥液混合均勻后，再一起滴加至NGM培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)基置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)若干小時后進(jìn)行實驗。

部分科學(xué)家認(rèn)為長壽和生殖力之間存在“利弊權(quán)衡”，即壽命延長和生殖能力成反比。延長壽命和生殖需要資源，而體內(nèi)的資源是有限的，延長線蟲壽命這部分資源應(yīng)該是來源于降低繁殖后代能力的資源[20]。但隨著進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，兩者并不總是成反比，如蔡外嬌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮不僅能延長線蟲壽命，而且能提高其生殖能力；何首烏中所含的白藜蘆醇在延長線蟲壽命的同時不影響其生殖能力[19]?？梢姡狙芯靠疾炀€蟲的生殖指標(biāo)是有意義的。在抗衰老研究中，壓力應(yīng)激實驗也是較為重要的[22]。研究顯示，壽命的延長有可能是因為應(yīng)激能力的提升，而且已知線蟲的長壽突變體在熱休克、氧化以及紫外輻射等壓力下，存活率均高于同等條件下的野生型線蟲[6]。

本研究僅采用野生型秀麗線蟲N2進(jìn)行壽命、生殖等生理指標(biāo)的測定，下一步可再采用某些基因型的突變體進(jìn)一步驗證所得結(jié)論。秀麗線蟲自身對外界環(huán)境影響較為敏感，在實驗過程應(yīng)盡量排除干擾因素，增大樣本，減少誤差。實驗過程中添加的二甲基亞砜是非質(zhì)子極性溶劑，也是一種透皮吸收劑，可促進(jìn)藥物的滲透。關(guān)于壽命實驗的分組，本研究只設(shè)置了空白組和EPM組，還可以考慮添加二甲基亞砜組。目前，線蟲實驗的給藥方式常用的有兩種，可設(shè)立這兩種不同加藥方式的分組，分別與空白組進(jìn)行比較，從而得出最佳的給藥方式。

本研究結(jié)果顯示，EPM組（37.5 mg/L）線蟲在各項指標(biāo)上與空白組比較均有顯著差異，這證明了EPM能延長線蟲平均壽命、提升線蟲生殖能力、延長線蟲在壓力應(yīng)激環(huán)境下的平均存活時間，具有延緩衰老的功效。本課題組后續(xù)將重點開展EPM抗衰老的機制研究。

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Anti-aging Effect Study of Ethyl Acetate Extract from Folygonum multiflora on Caenorhabditis Elegans

TANG Jinfa1，ZHANG Fan2，LI Yuhui2，WU Suhui2，LI Hanbing2，LI Weixia1，LI Xuelin1（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China；2.College of Pharmacy，Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To study the lifespan effect of ethyl acetate extract fromPolygonum multiflora（EPM）on caenorhabditis elegans，and to investigate its anti-aging effect.METHODS：EPM low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups（25，37.5，50 mg/L，calculated by crude drug）and blank group（0 mg/L）were established to investigate the effects of EPM on the lifespan of caenorhabditis elegans.EPM group（37.5 mg/L）and blank group（0 mg/L）were established to perform reproductive test，acute heat stress test and acute oxidative stress test of caenorhabditis elegans.The effects of EPM on reproductive capacity and pressure stress of caenorhabditis elegans were investigated.RESULTS：The lifespan test，average lifespan of cae-norhabditis elegans in EPM low-concentration，medium-concentration and high-concentration groups were prolonged significantly，compared to blank group（P＜0.05 or P＜0.01），especially in EPM medium-concentration group.In reproductive test，the number of offspring of caenorhabditis elegans in EPM group on the second and third day were increased significantly，compared to blank group（P＜0.05）.In acute heat stress test and acute oxidative stress test，average survival time of caenorhabditis elegans in EPM group was prolonged significantly（P＜0.05）.CONCLUSIONS：37.5 mg/L EPM can retard the aging process of caenorhabditis elegans and doesn't damage the reproductive capacity.

Polygonum multiflora；Ethyl acetate extract；Anti-aging；Caenorhabditis elegans；Lifespan；Oxidative stress；Heat stress

R285

A

1001-0408（2017）04-0493-04

2016-03-28

2016-06-20）

（編輯：林靜）

2015年度河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項課題（No.2015ZY02101）

＊副主任藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥動學(xué)。電話：0371-66233562。E-mail：a0519@163.com

#通信作者：主任藥師，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥的合理應(yīng)用及中藥的應(yīng)用形式。電話：0371-66245342。E-mail：lixuelin450000@ 163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.17