于 慧 劉美佳 劉劍利 曹向宇

(遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036)

玉米黃色素提取工藝優(yōu)化及其抗癌活性研究

于 慧 劉美佳 劉劍利 曹向宇

(遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036)

探究超聲輔助酶法制備玉米黃色素的最佳工藝，以及玉米黃色素對人胃腺癌細胞(BGC-823)生長的抑制作用。通過單因素和響應面試驗，探討超聲輔助酶法制備玉米黃色素的最佳條件；用制備的玉米黃色素處理BGC-823細胞，并進行形態(tài)學觀察和MTT法細胞存活率檢測，初步考察其抗癌活性。超聲輔助酶法提取玉米黃色素的最佳條件為：酶活力10 000 U/g，超聲功率400 W，酶解溫度35 ℃，該條件下提取率達最大，為(72.64±0.42) μg/g；細胞形態(tài)學觀察及MTT細胞活力檢測顯示玉米黃色素對BGC-823細胞具有一定的生長抑制作用。超聲輔助酶法提取玉米黃色素是一種有效的提取方法，制備的玉米黃色素對BGC-823細胞生長有較強的抑制作用。

玉米黃色素；超聲波；酶法；抗癌

玉米(ZeamaysL.)是禾本科玉米屬一年生草本植物，具有種植面積廣，產(chǎn)量大的特點?！秶壹Z食安全中長期發(fā)展規(guī)劃(2008～2020)年》制定的糧食增產(chǎn)目標中，玉米份額達到53%[1]。近年來，玉米的應用日益廣泛。在營養(yǎng)方面，玉米能量利用率較高。玉米中除了脂溶性維生素E和葉黃素含量較高，還含有谷胱甘肽，具有延緩衰老、增強免疫力等功能。在藥用方面，玉米具有降壓、降糖、防止動脈硬化、預防腫瘤之功效[2]。因此，玉米的研究與開發(fā)成為國內(nèi)外研究熱點，越來越受到人們的關(guān)注。

玉米黃色素(Corn Color)是一種可以從玉米中提取的幾種類胡蘿卜素的含氧衍生物的混合物，主要由玉米黃素、黃體素、隱黃素和β-胡蘿卜素組成[3]，可廣泛應用于醫(yī)藥、食品、包裝等行業(yè)[4]。玉米黃色素屬異戊二烯類色素，具有重要的生理功能，例如抑制腫瘤的增長，預防心腦血管疾病，增強人體免疫力和預防老年性視黃斑變性等[5]。因而開發(fā)和利用玉米中營養(yǎng)素——玉米黃色素具有重要的研究意義和經(jīng)濟價值。目前，對玉米黃色素的研究多集中于玉米黃色素的提取[6]、純化[7]、穩(wěn)定性[8]，而對其抗癌活性[9]、抗氧化活性[10]研究較少，且抗癌活性主要集中在乳腺癌[9]、卵巢癌研究[11]上。本試驗以BGC-823細胞為試驗研究對象，考察其抗胃癌活性，以期為人類健康和疾病預防提供一種明確生物活性的天然物質(zhì)。

傳統(tǒng)玉米黃色素的提取為有機溶劑浸提法，出于溶劑的安全性考慮，玉米黃色素的提取溶劑多選取乙醇，并輔以其它提取方法，以縮短提取時間并使提取更加充分[6]。超聲波借助機械振動，改變物質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)、狀態(tài)、功能或加速這些過程，從而增加溶劑對細胞壁的穿透力，強化浸提過程，縮短浸提時間，已被廣泛用于植物有效成分的提取。堿性蛋白酶可有效降解蛋白質(zhì)，釋放玉米黃色素，提高玉米黃色素的有效溶出率[12]。本研究擬采用超聲輔助酶法從玉米中提取玉米黃色素，采用響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，并在細胞水平上研究玉米黃色素對人胃腺癌細胞(BGC-823)的影響，以期為玉米黃色素的利用和抗癌功能開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米：華農(nóng)101，市售；

人胃腺癌細胞：BGC-823，中國醫(yī)科大學盛京醫(yī)院提供；

β-胡蘿卜素：標準品，純度≥98%，國藥集團化學試劑有限公司；

堿性蛋白酶：酶活力200 000 U/g，國藥集團化學試劑有限公司；

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)：純度≥98%，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平：BS223S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

高速冷凍離心機：JW-3021HR型，安徽嘉文儀器裝備有限公司；

熒光倒置顯微鏡：OLYMPUS DP73型，普赫光電(上海)科技有限公司；

可見光分光光度計：721N型，上海精密科學儀器有限公司；

冷凍干燥機：CHRIST型，北京鑫盛鴻陽科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52CS-2型，上海虹昕電子儀器儀表有限公司；

全自動酶標儀：Sunrise型，瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米黃色素的提取 玉米黃色素的提取方法參照朱洪梅[10]，略有改動。玉米預處理，洗凈，脫粒并粉碎，過120目篩備用。采用兩步法提取玉米黃色素，取過篩后的玉米粉，加入堿性蛋白酶進行酶法提取，之后加入無水乙醇進行超聲提取。浸提液4 000 r/min離心5 min，取上清液通過三層紗布過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對濾液進行濃縮，冷凍干燥得到粉末，具體工藝：

玉米→脫?！w粒粉碎→加酶水解→水浴→加乙醇→超聲→離心→取上清→過濾→濃縮→冷凍干燥

1.3.2 β-胡蘿卜素標準曲線的測定 根據(jù)文獻[13]，修改如下：以無水乙醇為溶劑準確稱取β-胡蘿卜素5.00 mg，定容至50 mL，然后分別取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL的溶液定容至10 mL，再將以上溶液分別稀釋10倍，在446 nm處測吸光值?？瞻讓φ战M選取無水乙醇，繪制標準曲線，得到β-胡蘿卜素標準回歸方程。

1.3.3 單因素試驗設計 對多個單因素進行預試驗，最終選取結(jié)果影響較大的3個因素，即：酶活力、酶解溫度、超聲功率，進行單因素試驗研究。

(1) 酶活力對玉米黃色素提取率的影響：稱取2.0 g玉米粉末，加入堿性蛋白酶，酶活力分別為4 000，8 000，12 000，16 000，20 000 U/g，加入40 mL蒸餾水，酶解時間4 h，酶解溫度30 ℃，之后加入60 mL 無水乙醇，超聲20 min，超聲功率200 W。浸提液4 000 r/min離心5 min，上清液在446 nm下測吸光度，每組試驗做3個平行。

(2) 酶解溫度對玉米黃色素提取率的影響：稱取2.0 g玉米粉末，加入堿性蛋白酶，酶活力12 000 U/g，加入40 mL蒸餾水，酶解時間4 h，酶解溫度分別為：20，30，40，50，60 ℃，之后加入60 mL 無水乙醇，超聲20 min，超聲功率200 W。浸提液4 000 r/min離心5 min，上清液在446 nm下測吸光度，每組試驗做3個平行。

(3) 超聲功率對玉米黃色素提取率的影響：稱取2.0 g玉米粉末，加入堿性蛋白酶，酶活力12 000 U/g，加入40 mL蒸餾水，酶解時間4 h，酶解溫度40 ℃，之后加入60 mL 無水乙醇，超聲20 min，超聲功率分別為：100，200，300，400，500 W。浸提液4 000 r/min離心5 min，上清液在446 nm下測吸光度，每組試驗做3個平行。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計 應用Design-Expert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken設計，以玉米黃色素提取率為響應值，對主要單因素(酶活力、超聲功率、酶解溫度)進行優(yōu)化，選取3因素3水平的旋轉(zhuǎn)組合設計，從中篩選提取玉米黃色素的最佳工藝條件。

1.3.5 玉米黃色素抗癌活性的測定

(1) 玉米黃色素對人胃腺癌細胞損傷的形態(tài)學觀察：根據(jù)文獻[14]，修改如下：將823細胞以每孔4×105個接種到6孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液體積2 mL，置于37 ℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后設置空白組，試驗組(玉米黃色素濃度0.25，0.50，1.00 mg/mL)，共同培養(yǎng)24 h，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

(2) 玉米黃色素對人胃腺癌細胞增值情況的影響：根據(jù)文獻[15]，修改如下：將823細胞以每孔3×103個接種到96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液體積200 μL，培養(yǎng)24 h后，設置空白組，試驗組(玉米黃色素濃度0.25，0.50，1.00 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT法檢測細胞活力。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 試驗重復3 次，結(jié)果取平均值，采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

在280～600 nm波長范圍內(nèi)對β-胡蘿卜素進行全波掃描，在446 nm處發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素最大波峰，因此本試驗中玉米黃色素的含量計算以446 nm下吸光值為準。在一定濃度范圍內(nèi)，β-胡蘿卜素的含量與其在446 nm處的吸光度值呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 6)，見圖1。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶活力對玉米黃色素提取率的影響 由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，隨酶活力的增加，玉米黃色素提取率也隨之提高，但當酶活力達到12 000 U/g時，玉米黃色素提取量達到最大值，之后隨酶活力的增加，玉米黃色素提取率呈下降趨勢。原因是當酶活力較低時，底物沒有被完全酶解，隨著酶活力的增加，玉米黃色素被逐漸釋放，但當酶活力大于12 000 U/g時，酶解反應達到飽和，所以提取率不再升高[16]。可見最佳酶活力為12 000 U/g時，此條件下，玉米黃色素提取率為(64.780±1.285) μg/g。

2.2.2 酶解溫度對玉米黃色素提取率的影響 由圖3可知，一定溫度范圍內(nèi)，玉米黃色素提取率隨溫度升高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當溫度達到40 ℃時，提取率達到最大值，為(65.69±1.21) μg/g，當溫度在40 ℃以上時，呈下降趨勢。因此玉米黃色素提取的最佳溫度為40 ℃。

2.2.3 超聲功率對玉米黃色素提取率的影響 由圖4可知，一定范圍內(nèi)，隨超聲功率的增加，玉米黃色素提取率逐漸提高，當超聲功率達到400 W時，玉米黃色素提取率達最大值，之后隨超聲功率的提高，玉米黃色素提取率不再升高，功率過大會增加能耗，從節(jié)能角度考慮，選取最佳超聲功率為400 W，此條件下，玉米黃色素提取率為(65.99±0.48) μg/g。

2.3 響應面試驗結(jié)果

以單因素結(jié)果為依據(jù)，細化因素水平，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理得到響應面因素設計水平，見表1。

根據(jù)試驗設計得到的試驗結(jié)果見表2。

2.4 回歸模型方差分析

利用軟件設計Design-Expert 8.0.6 對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得酶活力、超聲功率、酶解溫度的二元多項回歸方程：

Y=68.0-4.70A+1.28B-1.18C-0.91AB-0.37AC+0.49BC-1.14A2-3.01B2+0.22C2。

(1)

由表3可知，模型P<0.000 1，模型顯著，失擬項P=0.422 3，失擬項不顯著，另外酶活力的一次項，超聲功率的一次項，酶解溫度的一次項，酶活力與超聲功率的交互項，酶活力與酶解溫度的交互項，超聲功率與酶解溫度的交互項，酶活力的二次項，超聲功率的二次項均達到極顯著水平(P<0.01)；酶解溫度的二次項達到顯著水平(P<0.05)。由F值可以看出各因素影響結(jié)果的主次順序是A>B>C。模型R2=0.999 2，表明模型與實際擬合程度好，模型能夠解釋大多數(shù)因變量的變化。綜上，模型成立，擬合程度較好，試驗誤差較小。

2.5 各因素交互作用的響應面分析

由圖5(a)可知，當酶活力一定時，提取率隨超聲功率的增加，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；當超聲功率一定時，隨酶活力增加提取率呈下降趨勢。響應曲面的坡度陡峭，表明響應值對酶活力和超聲功率比較敏感，等高線的疏密程度可知，酶活力和超聲功率的交互作用明顯，影響顯著。最優(yōu)點十分接近酶活力1 000 U/g和超聲功率400 W，并且在這個點提取率有最大值。由圖5(b)可知，當酶活力一定，提取率隨酶解溫度的升高逐漸升高；當酶解溫度一定時，提取率隨酶活力的增加逐漸下降。從等高線可看出，兩因素的交互作用較強，影響顯著，相比于酶解溫度，提取率對酶活力更為敏感。由圖5(c)可知，當超聲功率一定時，隨酶解溫度的升高，提取率逐漸增加；當酶解溫度一定時，隨著超聲功率的增加，提取率呈先升高后下降的趨勢。響應曲面的坡度較為陡峭，可知響應值對超聲功率和酶解溫度比較敏感；由等高線疏密程度可知，超聲功率和酶解溫度的交互作用較顯著。最優(yōu)點接近于超聲功率400 W和酶解溫度35 ℃，并且在該點提取率有最大值。

? ** 表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。

Figure 5 Response surface and contour plots for the effects of interaction between enzyme activity and ultrasonic power, between enzyme activity and enzyme solution temperature, between ultrasonic power and enzyme solution temperature on the yield of extraction ratio

2.6 驗證實驗結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6軟件設計，得玉米黃色素提取最佳工藝參數(shù)為酶活力10 000 U/g，超聲功率413.99 W，酶解溫度35 ℃，此條件下玉米黃色素理論提取率為72.90 μg/g。考慮到實際操作中遇到問題，將提取工藝修整為：酶活力10 000 U/g，超聲功率400 W，酶解溫度35 ℃，對優(yōu)化參數(shù)進行3次重復實驗得玉米黃色素提取率為(72.64±0.42)μg/g。預測值與實驗值非常接近，進一步證明試驗設計和數(shù)學模型具有可靠性和重現(xiàn)性。

2.7 玉米黃色素對人胃癌細胞損傷的形態(tài)學觀察結(jié)果

由圖6、7可知，空白對照組細胞貼壁狀態(tài)良好，棱角清晰。隨玉米黃色素試驗組劑量的增加，細胞貼壁數(shù)目逐漸減少，其中1.00 mg/mL玉米黃色素組細胞明顯變圓收縮，貼壁數(shù)目是空白組的47.2%，與空白組相比，差異極顯著(P<0.01)，說明玉米黃色素對人胃癌細胞具有抑制作用，并且呈現(xiàn)劑量—效應關(guān)系。陸雪瑩等[17]選取木犀草素處理BGC-823細胞，凋亡細胞表現(xiàn)為細胞間隙增大，體積縮小，細胞邊緣模糊，細胞折光性減弱，與玉米黃色素處理組細胞形態(tài)相似。

2.8 玉米黃色素對人胃癌細胞增值情況的影響

由圖8可知，玉米黃色素能夠有效抑制823細胞的生長，當加入1.00 mg/mL玉米黃色素，細胞存活率變?yōu)?2.1%，與空白組比較差異極顯著，并且隨玉米黃色素劑量的升高，對細胞抑制效果增強，呈現(xiàn)劑量效應關(guān)系。李曉伶等[9]研究表明，當玉米黃色素濃度為53.21 μg/mL時，人卵巢透明癌(ES-2)細胞抑制率達到50%，當玉米黃色素為62.21，61.93，98.60 μg/mL時，對人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)、人肺癌細胞(A549)、前列腺癌細胞(PC-3)也具有同樣的抑制效果。宋佳等[18]試驗結(jié)果表明，酒糟中玉米黃色素對宮頸癌(Hela)細胞也具有抑制作用，當濃度20 μg/mL時，抑制率達到31.98%?？梢娪衩S色素具有抑制癌細胞增值的作用，但對不同癌細胞的抑制情況不同。

**與空白組相比差異極顯著，P<0.01；*與空白組相比差異顯著，P<0.05

圖8 玉米黃色素對人胃癌823細胞存活率的影響

Figure 8 Effect of maize yellow pigment on viability of 823 cells

3 結(jié)論

本試驗通過對酶活力、超聲功率、酶解溫度3個因素的探究，建立了影響玉米黃色素得率的二次多項數(shù)學模型，優(yōu)化得出玉米黃色素超聲輔助酶法提取的最佳工藝條件為：酶活力10 000 U/g，超聲功率400 W，酶解溫度35 ℃；最佳條件下的得率為(72.64±0.42) μg/g。通過形態(tài)學觀察及MTT細胞活力檢測表明玉米黃色素對人胃癌細胞具有一定損傷作用。通過試驗表明超聲輔助酶法制備玉米黃色素是一種有效的方法，制備的玉米黃色素具有一定抗癌活性，但其確切抗胃癌機制還有待進一步研究。

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Extraction process optimization and anticancer activity of maize yellow pigment

YU HuiLIUMei-jiaLIUJian-liCAOXiang-yu

(SchoolofLifeScience,LiaoningUniversity,Shenyang,Liaoning110036,China)

Objective: To study the best preparation technology of maize yellow pigment by ultrasonic assisted with enzymatic method, and the inhibitory effect of them on the growth of human gastric cancer cells (BGC-823). Methods: The optimum conditions of maize yellow pigment were extracted by ultrasonic assisted with enzymatic method by single factor and response surface experiments. The inhibition of maize yellow pigment on BGC-823 cells was detected by morphological observation and MTT assay to evaluate the antitumor activity. Results: the maize yellow pigment best extraction condition of ultrasonic with enzymatic method is: enzyme activity 10 000 U/g, ultrasonic power 400 W, enzymolysis temperature 35 ℃, the maximum extraction yield was (72.64 ± 0.42) μg/g under the condition, the maize yellow pigment has a certain inhibitory effect on BGC-823 cell were studied by cell morphological observation and MTT test. Conclusion: The extraction of maize yellow pigment by ultrasonic assisted with enzymatic method is a kind of effective extraction method, the maize yellow pigment prepared has strong inhibitory effect on BGC-823 cells.

maize yellow pigment; ultrasonic; enzymic method; anticancer

國家自然科學基金委員會科學部主任基金項目(編號：31240005)；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)資助計劃項目(編號：2015013)；遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃項目(編號：LJQ2013002)；遼寧省高等學?？茖W研究一般項目(編號：L2014007)；遼寧大學博士科研啟動項目

于慧，女，遼寧大學在讀碩士研究生。

曹向宇(1980—)，男，遼寧大學教授，博士。 E-mail：xycaolnu@163.com

2016—12—15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.029