龔 亮 熊 珺 余以剛

(1. 廣東省東莞市質(zhì)量監(jiān)督檢測中心，廣東 東莞 523808；2. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定食品中的有機(jī)硒

龔 亮1,2熊 珺1余以剛2

(1. 廣東省東莞市質(zhì)量監(jiān)督檢測中心，廣東 東莞 523808；2. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

建立食品中有機(jī)硒直接測定的方法。在pH值為7.0的水溶液中加入環(huán)己烷超聲萃取有機(jī)硒，萃取液經(jīng)微波消解后進(jìn)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定有機(jī)硒的含量。在最佳測試條件下，方法檢出限為0.45 μg/kg，定量限為1.5 μg/kg，試樣加標(biāo)回收率為93.5%～103.0%。該方法具有操作簡便，精密度高，線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，適用于食品中有機(jī)硒含量的測定，在實(shí)際檢測中有廣泛的應(yīng)用前景。

電感耦合等離子體質(zhì)譜；超聲萃??；微波消解；有機(jī)硒；食品

硒的形態(tài)主要分為無機(jī)硒和有機(jī)硒，據(jù)研究[1-3]，無機(jī)硒的毒性大并且生物活性低，有機(jī)硒的毒性小，被生物吸收和利用率高。因此，有機(jī)硒食品的開發(fā)成為熱點(diǎn)，相應(yīng)的檢測技術(shù)也愈來愈受到重視。

目前，對食品中有機(jī)硒的測定主要是原子熒光光譜法[4-6]，通過測定食品中總硒和無機(jī)硒含量，然后利用差減法間接得出有機(jī)硒的含量。但該方法操作步驟多，耗時長，試劑消耗量大?；诖?，本試驗(yàn)擬通過摸索和條件優(yōu)化，旨在建立一種簡單高效、環(huán)境友好的食品中有機(jī)硒總量的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

硒標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，中國計量科學(xué)研究院；

硒胱氨酸(SeCys2，有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)品)：98%，美國Aldrich公司；

甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys，有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)品)：95%，美國Sigma公司；

鍺標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 μg/mL，上海市計量測試技術(shù)研究院；

硝酸、鹽酸：優(yōu)級純，德國CNW科技公司；

雙氧水：優(yōu)級純，廣州化學(xué)試劑廠；

環(huán)己烷、氫氧化鈉：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

試驗(yàn)用水：電阻率18.2 MΩ·cm的超純水，由Milli-Q超純水儀制備；

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)：7700x型，美國Agilent科技公司；

微波消解儀：Ethos，配帶智能控溫趕酸器，意大利Milestone公司；

研磨儀：A11，意大利IKA公司；

超聲儀：SY-1030F型，東莞市三源超聲波設(shè)備有限公司；

pH計：SG2-ELK型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q，美國Millipore公司；

所有玻璃器皿均用20% HNO3浸泡24 h，并依次用蒸餾水和超純水洗滌，晾干待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 稱取經(jīng)研磨粉碎樣品1.0 g于100 mL三角燒瓶中，加30 mL 水充分混勻后，用1 mol/L鹽酸溶液或1.25 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值為7.0，加入10 mL環(huán)己烷，放入超聲儀中，在1 500 W功率下超聲萃取20 min，吸取上層有機(jī)相到微波消解罐中；同法再超聲萃取一次，合并上層有機(jī)相至相同消解罐中；將盛有環(huán)己烷萃取液的消解罐置于智能控溫趕酸器中90 ℃揮至近干。放冷后于消解罐中加入過氧化氫2.0 mL 和硝酸6.0 mL進(jìn)行微波消解，微波消解條件參照表1。消解完成，冷卻后取出消解罐，開蓋，在智能控溫趕酸器上160 ℃加熱揮酸至剩余1～2 mL，冷卻后轉(zhuǎn)移至25.0 mL容量瓶或比色管中，用去離子水少量多次沖洗消解罐，合并洗液，用超純水定容至刻度，搖勻待測。每個試樣稱取3個平行，同時做試劑空白試驗(yàn)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制 ICP-MS檢測的是元素的總量，與被測物的形態(tài)和價態(tài)無關(guān)，因此使用總硒標(biāo)準(zhǔn)溶液即可滿足本試驗(yàn)的需要。將100 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液用5%硝酸溶液逐級稀釋配制成以下標(biāo)準(zhǔn)系列：硒濃度為0.00，1.00，5.00，20.0，50.0，100.0 μg/L。內(nèi)標(biāo)溶液的配制：以鍺元素作為內(nèi)標(biāo)，用5%硝酸溶液逐級稀釋至使用濃度為1.0 μg/mL。

1.2.3 儀器參數(shù)的優(yōu)化 按儀器使用方法開機(jī)預(yù)熱穩(wěn)定后，用儀器專用質(zhì)譜調(diào)諧液(Li、Mg、Co、Y、Ce、Tl，1.0 μg/L)對儀器進(jìn)行最優(yōu)化調(diào)諧，使儀器的分辨率、靈敏度、雙電荷和氧化物等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合測定要求。儀器工作參數(shù)：射頻(RF)功率1 600 W，等離子體氣流量15 L/min，載氣流量0.34 L/min，稀釋氣體流量0.59 L/min，氦氣流量5.0 mL/min，霧化室溫度2 ℃，樣品提升泵速率0.5 r/s，樣品分析泵速率0.1 r/s；采用玻璃同心霧化器，鎳錐截取錐，采樣深度10 mm；采集模式：質(zhì)譜圖，積分時間3 s，每峰測定點(diǎn)數(shù)3，重復(fù)次數(shù)3；分析模式：[He]碰撞反應(yīng)池。

1.2.4 定量測定 儀器參數(shù)設(shè)置和調(diào)諧完成后，打開方法編輯器設(shè)置好測定方法和數(shù)據(jù)處理方法，由三通進(jìn)樣管在線加入內(nèi)標(biāo)，觀察內(nèi)標(biāo)的靈敏度和穩(wěn)定性情況，符合要求后，將標(biāo)準(zhǔn)系列、試劑空白、樣品消化液分別導(dǎo)入儀器。儀器自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由回歸方程分別計算出樣液中硒元素的濃度。

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計

(1) 提取液pH對有機(jī)硒測定的影響：試驗(yàn)添加有機(jī)硒標(biāo)液并加水至30 mL，調(diào)節(jié)提取液的pH，加入環(huán)己烷10 mL，超聲萃取，微波消解后測定，考察提取液pH值(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)對有機(jī)硒加標(biāo)回收率的影響。

(2) 萃取方法對有機(jī)硒測定的影響：稱取同一魚肉樣品1.0 g，加入水30 mL，調(diào)節(jié)樣品提取液的pH為7.0，加入環(huán)己烷10 mL，分別用分液漏斗萃取和超聲萃取，經(jīng)微波消解后測定，考察不同萃取方法對有機(jī)硒測定的影響。

(3) 萃取溶劑對有機(jī)硒測定的影響：稱取同一魚肉樣品1.0 g，加入水30 mL，調(diào)節(jié)樣品提取液的pH為7.0，加入甲苯或環(huán)己烷10 mL，超聲萃取，經(jīng)微波消解后測定，考察不同萃取溶劑對有機(jī)硒測定的影響。

(4) 消解方法對有機(jī)硒測定的影響：稱取同一魚肉樣品1.0 g，加入水30 mL，調(diào)節(jié)樣品提取液的pH為7.0，加入環(huán)己烷10 mL，超聲萃取，分別使用干灰化法、濕消解和微波消解后測定，考察不同消解方法對有機(jī)硒測定的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取液pH的影響 運(yùn)用相似相溶原理，無機(jī)硒溶于水，有機(jī)硒溶于環(huán)己烷；溶液的酸堿度可以改變硒的有機(jī)化合物在水和環(huán)己烷中的分配系數(shù)；不同形態(tài)的硒對亞甲藍(lán)的退色時間不同，亞甲藍(lán)在有機(jī)硒作用下褪色時間為5～10 min，而無機(jī)硒作用下則為30～60 s[7]，根據(jù)退色時間不同來判斷有機(jī)硒的提取效率，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液的pH值為6.0～7.5時，有機(jī)硒在環(huán)己烷中溶解最大，并且采用超聲配合萃取，樣品中的無機(jī)硒能夠快速完全進(jìn)入水相中，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)硒和無機(jī)硒的完全分離，試驗(yàn)加標(biāo)回收結(jié)果見圖1。本試驗(yàn)選擇樣品提取液的pH為7.0。

2.1.2 萃取方法的選擇 對于液液萃取，經(jīng)典方法有分液漏斗萃取和超聲萃取。試驗(yàn)考察了兩種萃取方法對有機(jī)硒測定的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，超聲萃取的測定結(jié)果比分液漏斗萃取的高，穩(wěn)定性更好。并且相對于超聲萃取，分液漏斗萃取方法操作更繁瑣，用時更久。故本試驗(yàn)選取超聲萃取作為萃取方法。

2.1.3 萃取溶劑的選擇 有機(jī)硒能溶解于甲苯和環(huán)己烷中，甲苯極微溶于水，環(huán)己烷不溶于水，這兩種溶劑都可用來提取有機(jī)硒。試驗(yàn)考察了兩種萃取溶劑對有機(jī)硒測定的影響，結(jié)果見表3。由表3可知，兩種萃取溶劑對測定結(jié)果沒有明顯差別，但考慮到甲苯毒性較大，故選擇環(huán)己烷作為萃取溶劑。

2.1.4 消解方法的確定 試驗(yàn)考察了干灰化法、濕消解和微波3種消解方法對有機(jī)硒測定的影響，結(jié)果見表4。由表4可知，微波消解法的測試結(jié)果最高，平行性最好。干灰化法在高溫下進(jìn)行，有機(jī)硒損失最大。濕消解試劑用量大，消解時間長，操作步驟繁多，穩(wěn)定性差。故本試驗(yàn)選擇微波消解作為樣品的消解方法。

2.2 精密度試驗(yàn)和方法的檢出限

有機(jī)硒種類繁多，形態(tài)復(fù)雜，據(jù)報道[8-11]在檢出有機(jī)硒的食品中大多含有SeCys2和MeSeCys。本試驗(yàn)以在實(shí)際樣品中加入SeCys2和MeSeCys的方法考察精密度：在稱好的樣品中加入配制好的有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，加入量0.2 mg/kg，按本方法確定的條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，由表5可知，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤ 5%，方法加標(biāo)回收率在93.5%～103.0%。本方法用于測定食品中有機(jī)硒含量具有較好的精密度。

依據(jù)1.2.1條稱取1.0 g試樣進(jìn)行樣品處理，定容至25 mL，按照1.2.2條配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，連續(xù)測定空白試樣11次。計算響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以儀器響應(yīng)值的3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以工作曲線斜率，再以1.0 g取樣量定容至25 mL，計算出本方法的檢出限和定量限，線性方程：y=458.4x-0.547 9，擬合系數(shù)：0.999 6，檢出限：0.45 μg/kg，定量限：1.5 μg/kg。

2.3 方法比對試驗(yàn)

分別用GB 5009.93—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測定》的方法測定總硒，DBS 42/002—2014《湖北省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 富有機(jī)硒食品硒含量要求》的方法測定無機(jī)硒，本試驗(yàn)建立的方法測定有機(jī)硒，結(jié)果見表6。由表6可知，本試驗(yàn)建立的方法測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法的比率在94.7%～103.3%，說明該方法可行，結(jié)果可信。

2.4 實(shí)際樣品的測定

將方法應(yīng)用于市售22種常見食品中有機(jī)硒的測定，結(jié)果見表7。由表7可知，家禽和水產(chǎn)動物類、藻類、菌類等均含有有機(jī)硒，相對而言，牛肝菌中有機(jī)硒含量最高，動物肝臟中的含量明顯高于其肉體，而飲用水、蔬菜、大米、水果、調(diào)味品等未檢出有機(jī)硒。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了直接測定食品中有機(jī)硒的方法，在pH值為7.0的水溶液中加入環(huán)己烷超聲萃取有機(jī)硒，經(jīng)微波消解萃取液后采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，方法靈敏度高，線性范圍廣，操作簡便，彌補(bǔ)了直接測定食品中有機(jī)硒的方法空缺，為客觀評價食品的質(zhì)量提供了科學(xué)方法。本試驗(yàn)方法只能夠快速測定食品中有機(jī)硒總含量，但對有機(jī)硒價態(tài)的評定和種類的定性，還需要借助質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)做進(jìn)一步研究。

? 比率=有機(jī)硒/(總硒-無機(jī)硒)×100%。

? “N.D.”表示未檢出，定量限為1.5 μg/kg。

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Determination of Organic Selenium in Food by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry

GONG Liang1,2XIONGJun1YUYi-gang2

(1.GuangdongDongguanQualitySupervisionTestingCenter,Dongguan,Guangdong523808,China; 2.CollegeofFoodSciencesandTechnology,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,Guangdong510640,China)

A method was established to direct determination of organic selenium in food. The organic selenium was extracted by adding cyclohexane in aqueous solution with pH value of 7.0, and the content of organic selenium was determined by inductively coupled plasma mass spectrometry after microwave digestion. In the best test conditions, the limit of detection and quantification were 0.45 μg/kg and 1.5 μg/kg, respectively. The recoveries ranged from 93.5% to 103.0%. The method has many advantages such as simple operation, high precision, wide linear range and so on, and can be used for accurate determination of selenium in food. So it has a wide application prospect in practical detection.

Inductively coupled plasma mass; ultrasound extraction; microwave digestion; organic selenium; food

廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目(編號：2013ZS01)；廣東省科技計劃項(xiàng)目(編號：2016B090918103)

龔亮，男，廣東省東莞市質(zhì)量監(jiān)督檢測中心工程師，碩士。

余以剛(1968—)，男，華南理工大學(xué)教授，博士。 E-mail: yuyigang@scut.edu.cn

2017—01—03

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.013