張梅梅索化夷 趙 欣 騫 宇李 鍵 丁陽平 張 玉

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 西南大學重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715；3. 重慶第二師范學院重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；4. 西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041)

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中細菌素產生菌的篩選與鑒定

張梅梅1,2,3索化夷1,2趙 欣3騫 宇3李 鍵4丁陽平1張 玉1

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 西南大學重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715；3. 重慶第二師范學院重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；4. 西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041)

從西藏羊八井地區(qū)、云南香格里拉的傳統(tǒng)牦牛酸乳中分離出26株乳酸菌，以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及釀酒酵母為指示菌。采用牛津杯雙層瓊脂擴散法檢測菌株的抑菌譜大小，并經過有機酸排除、過氧化氫排除、蛋白酶水解檢測試驗，最終篩選得到5株產細菌素的菌株，編號分別為3、23、24、21和25。通過微生物形態(tài)學與16S rDNA 序列同源性分析，鑒定這些菌株分別為干酪乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸乳球菌乳球亞種。抑菌譜試驗表明，這些細菌素能夠抑制部分食源性革蘭氏陽性菌和陰性致病菌，對真菌無抑菌活性。

牦牛酸乳；乳酸菌；細菌素；篩選；鑒定

牦牛是極端高原環(huán)境下的代表性家畜，在中國主要分布于青藏高原地區(qū)，是牧民主要的生產生活資料[1]。中國共有牦牛1 400多萬頭，占全世界牦?？倲?shù)的95%以上[2]。牦牛酸乳是由牦牛乳經傳統(tǒng)發(fā)酵方法制得，發(fā)酵過程受極端環(huán)境因素的影響，有著復雜的微生物菌群，研究[3]表明這些牦牛酸乳中蘊含著豐富的乳酸菌資源。

細菌素是指乳酸菌在代謝過程中由核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白質復合物[4]。它可以選擇性地殺死腸道內有害微生物、提高腸道免疫力，控制大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等食源性致病菌，抑制或消滅乳制品、肉制品、果汁飲料等食品中的腐敗菌，代替抗生素作為飼料添加劑[5-7]。具替代天然防腐劑和抗生素的潛在應用價值，因此是乳酸菌功能性研究領域的一大熱點。

傳統(tǒng)發(fā)酵的牦牛酸乳中蘊含著豐富的乳酸菌資源，從中篩選出抑菌活性強的細菌素產生菌，對于細菌素的制備和投入生產具有重要意義。目前只有少數(shù)學者研究的細菌素產生菌株來源于青藏高原的牦牛酸乳。陳芝蘭等[8]從西藏地區(qū)發(fā)酵牦牛乳中分離出7株產細菌素的乳酸菌，研究表明這些菌株發(fā)酵上清液對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯抑制作用，對真菌無抑制活性。楊吉霞等[9]從青藏高原的牦牛奶酪中篩選出Y13菌株，其細菌素粗提液對蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、單增李斯特菌、費氏檸檬酸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌有較強的抑制作用。丁武蓉[10]從青藏高原的牦牛酸乳中篩選出德氏乳桿菌保加利亞亞種F17，其對金黃色葡萄球菌和李斯特菌有抑制作用。張艷[11]、崔琴[12]和張麗[13]也分別從四川和甘肅地區(qū)牦牛酸奶中篩選和鑒定產細菌素的乳酸菌菌株，其對常見的病原菌均有很好的抑制作用。本研究擬采用分離自西藏羊八井地區(qū)和云南香格里拉的26株乳酸菌作為供試菌株，篩選、鑒定出產細菌素的菌株，并對其抑菌特性和抑菌譜進行初步研究，以期為天然生物防腐劑工業(yè)化的開發(fā)和醫(yī)藥利用提供研究基礎，為中國極端環(huán)境下乳酸菌菌種資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

供試菌株：26株乳酸菌菌株，1～10號分離自西藏羊八井地區(qū)牦牛酸乳，11～26號分離自云南香格里拉牦牛酸乳；

指示菌：致病性菌株(枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)、非致病性菌株(釀酒酵母)，均為西南大學食品科學學院保藏。

1.1.2 試劑

瓊脂、MRS 肉湯、LB 肉湯、馬鈴薯葡萄糖肉湯、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶：生化試劑，北京索萊寶科技有限公司；

細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、2×Taq PCR MasterMix：天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設備

電子顯微鏡：OLYMPUS-BX43型，奧林巴斯有限公司；

牛津杯：內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm，東臺市吉泰不銹鋼制品廠；

游標卡尺：0～150 mm，無錫錫工量具有限公司；

梯度PCR儀：S1000 Thermal Cycler型，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的活化鏡檢 無菌條件下將26個凍干保藏管開封并加生理鹽水使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸出并移入盛有5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，即為F1代培養(yǎng)液。將F1代培養(yǎng)液以1% 的接種量轉接于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，得到F2代菌株。分別在MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線，驗證菌株純種。與此同時，對所有菌株作革蘭氏染色，電子顯微鏡觀察染色菌體細胞，再次驗證菌株純種[14]。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備 參考文獻[15]12。

1.3.3 細菌素產生菌的初篩

(1) 指示菌菌懸液的制備[15]12：各指示菌經24 h培養(yǎng)后，用微量加液器取5 mL含鹽量為0.85%的生理鹽水沖洗長滿菌落的試管斜面，菌液轉裝到5 mL的無菌試管中，振蕩均勻后制得菌懸液。通過梯度濃度稀釋，得到含菌量約為108CFU/mL的指示菌菌液。

(2) 菌株抑菌譜大小及抑菌活性的檢測[16-17]：采用牛津杯雙層瓊脂擴散法。制成雙層培養(yǎng)基平板后，將滅過菌的牛津杯用無菌鑷子均勻地放入雙層培養(yǎng)基平板中。放置5 min后，利用移液槍向每個牛津杯中加200 μL乳酸菌發(fā)酵上清液，分別于適宜的溫度下培養(yǎng)24 h后，牛津杯中上清液己完全被吸收。采用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，挑選出抑菌效果好、抑菌譜較廣的菌株。

1.3.4 細菌素產生菌的復篩 參考文獻[18～19]做排除有機酸、過氧化氫試驗和對蛋白酶的敏感性試驗。

1.3.5 細菌素產生菌的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹構建 取經過初篩與復篩的菌株培養(yǎng)液按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明對菌株進行 DNA 提取，并儲存于-20 ℃?zhèn)溆?。PCR反應采用25 μL體系：模板 1 μL、27F(10 μmol/L) 1 μL、1495R(10 μmol/L) 1 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，加入ddH2O補足至25 μL。設置陰性對照，加入以上除了模板的所有試劑，準備完畢后進行PCR擴增。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1.5 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應結束后，取5 μL PCR產物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。由北京華大基因公司對5株菌16S rDNA進行測序。將所得序列通過NCBI中的GenBank，使用BLAST程序進行比對分析。從GeneBank數(shù)據(jù)庫中調取參考菌株序列，使用Clustalx 1.83軟件進行序列匹配比對，通過MEGA 5.0軟件中Neighbor-Joining構建分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，置信度檢測采用自舉法，自舉數(shù)據(jù)集為1 000[20-22]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌活化菌株形態(tài)結構

由圖1可知，21、23和25號菌株經培養(yǎng)后，菌落呈乳白色，表面光滑且凸起，邊緣整齊。菌株經革蘭氏染色后，在顯微鏡下呈藍紫色，形態(tài)分別為桿狀和球形，符合乳酸菌特征。

2.2 細菌素產生菌的初篩結果

采用牛津杯雙層瓊脂擴散法檢測抑菌譜大小，部分初篩效果見圖2，產生的抑菌譜見表1。與前人[15]43[18-23]的初篩結果進行對比，從26株乳酸菌中篩選出7株對致病性指示菌均有較強抑制作用的菌株。它們的編號分別為3、10、11、21、23、24、25，抑菌結果見圖3。

由圖3可知，所篩選出的7株乳酸菌菌株既抑制革蘭氏陽性菌，又抑制革蘭氏陰性菌，且抑菌活性較高，其上清液對枯草芽孢桿菌的抑菌效果好于金黃色葡萄球菌。由表1可知，21號菌對枯草芽孢桿菌抑制效果最好，其抑制圈直徑為18.48 mm；11號菌對大腸桿菌抑制效果最好，其抑制圈直徑為14.64 mm；21號菌對金黃色葡萄球菌抑制效果最好，其抑制圈直徑為11.70 mm，所有菌株對釀酒酵母無抑菌活性。

? -表示抑菌圈直徑≤8 mm；+表示抑菌圈直徑8～10 mm；++表示抑菌圈直徑10～12 mm；+++表示抑菌圈直徑≥12 mm。

2.3 細菌素產生菌的復篩結果

2.3.1 有機酸排除結果 抑制指示菌的物質可能是細菌素也可能是酸，因此需要排除有機酸的干擾。將去除菌體的發(fā)酵上清液的pH 值調至4.5[15]17，以致病性菌株為指示菌進行抑菌試驗，抑菌結果見表2。

由表2可知，當把MRS液體培養(yǎng)基的pH調到4.5時，對指示菌無抑制作用，而發(fā)酵上清液在此pH條件下有抑制作用，說明發(fā)酵上清液中確有抑菌活性物質存在[24]。編號為3、21、23、24、25菌株的發(fā)酵上清液pH調為4.5后，其對各指示菌抑菌活性的下降都低于15%。姚麗婭等[25]從傳統(tǒng)發(fā)酵制品中分離出的S1-1菌株經有機酸排除試驗后，其抑菌活性下降了26.47%?；打E[15]17從黃瓜汁里分離出的H1菌株，經有機酸排除試驗后，其對枯草芽孢桿菌的抑菌活性分別下降了30%。因此這些菌株經有機酸排除試驗后，不僅具有抑菌作用，而且抑菌作用相對理想。故各菌株的抑菌性不是有機酸作用的結果，還有其他抑菌物質存在。

2.3.2 過氧化氫排除結果 過氧化氫是乳酸菌的一種代謝合成產物，能夠抑制微生物的生長，因此必須排除過氧化氫的干擾。故將上述7株菌的發(fā)酵上清液經80 ℃加熱處理10 min，使過氧化氫充分分解，冷卻后以致病性菌株為指示菌進行試驗，抑菌結果見表3。

由表3可知，7株菌株經過氧化氫排除試驗后，抑菌圈直徑均無明顯變化。其中11號菌株加熱前后對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑變化最大，其抑菌性下降了8.60%。曹珂珂等[26]從植物性原料中分離出的B-17菌株，其發(fā)酵上清液經 80 ℃水浴 10 min后，抑菌性下降了10.3%。張彥斌等[27]從內蒙古傳統(tǒng)乳制品中分離的S4-3-1菌株用過氧化氫酶處理發(fā)酵上清液，其抑菌活性下降了15.51%。由此可見，這7株菌仍有較強的抑菌性，說明發(fā)酵上清液中主要的抑菌物質不是過氧化氫。

2.3.3 菌株的酶水解試驗結果 在排除有機酸和過氧化氫的抑菌作用后，以這7株菌作為目的菌株，以枯草芽孢桿菌為指示菌。對其發(fā)酵上清液進行胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶水解試驗，以檢測發(fā)酵液中具有較強抑菌性的物質是否為蛋白質，結果見表4。

由表4可知，酶處理后3、21、23、24和25菌株上清液產生的抑菌圈明顯小于原上清液產生的抑菌圈，其中21號菌株對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑明顯減小，抑菌活性下降了58.23%。但10、11號菌株的抑菌活性下降得較少，分別為2.00%和3.08%，可見其抑菌物質對蛋白酶不敏感。由于細菌素具有蛋白質特性，因而在各種消化酶處理后，其抑菌活力會有不同程度的下降[28]。因此可以初步推測3、21、23、24和25這5株乳酸菌產生的抑菌物質具有蛋白質性質，即細菌素；10、11號菌株其抑菌物質含蛋白質類似物極少，因此其活性物質為非蛋白組分或者起抑菌作用的不是單一的物質。

2.4 細菌素產生菌的16S rDNA序列同源性鑒定結果

通過對牦牛酸乳中分離出的乳酸菌進行細菌素產生菌的初篩和復篩，綜合比較得出編號為3、21、23、24、25菌株有較好的抑菌活性。這5株菌株總DNA經PCR 擴增、電泳后的結果見圖4，可知擴增后的電泳條帶集中在1 500 bp左右，符合乳酸菌擴增片段長度；陰性對照無條帶，說明未出現(xiàn)污染。16S rDNA 比對結果見表5。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將5株分離菌株測序結果與GenBank中已有序列進行比對分析，結果表明分離菌株同源性均在100%，大于分類研究閾值97%[29]，系統(tǒng)發(fā)育樹中，各分支長度間的差異代表物種進化程度的高低。由圖5可知，鑒定已知的5株乳酸菌分為2個進化枝，表明5株乳酸菌分為2個遺傳類型。干酪乳桿菌(編號為3、23、24)和植物乳桿菌(編號為21)處在同一分枝中，乳酸乳球菌乳球亞種(編號為25)處于另一分支，表明干酪乳桿菌與植物乳桿菌的親緣關系很近，同屬于乳桿菌屬。因此試驗菌株涉及乳球菌屬和乳桿菌屬。其中編號為3、23、24、21和25 的菌株都以100% 的自舉支持率分別與干酪乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸乳球菌乳球亞種聚在一起?？梢姡到y(tǒng)發(fā)育樹分析結果與16S rDNA 序列分析結果相一致。

3 結論

本試驗通過對傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中細菌素產生菌的篩選，得到5株對致病性指示菌(枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)有較好抑制作用的乳酸菌，經微生物形態(tài)學與分子生物學鑒定結果表明，編號 3、23和24菌株為干酪乳桿菌、編號21菌株為植物乳桿菌、編號25菌株為乳酸乳球菌乳球亞種。干酪乳桿菌、植物乳桿菌和乳酸乳球菌乳球亞種均為食品上可用菌，而在已有的細菌素產生菌的篩選研究中，所得菌株很多并非食品中可用。因此本研究的結果可用于食品中以防范食源致病菌對食品的污染。

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Screening and identification of lactobacillin-producing strain in traditional yak yogurt

ZHANG Mei-mei1,2,3SUOHua-yi1,2ZHAOXin3QIANYu3LIJian4DINGYang-ping1ZHANGYu1

(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2.ChongqingEngineeringResearchCenterofRegionalFood,Chongqing400715,China; 3.ChongqingCollaborativeInnovationCenterforFunctionalFood,ChongqingUniversityofEducation,Chongqing400067,China; 4.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041,China)

The 26 strains isolated from traditional fermented yak milk in Yangbajin-Tibet and Yunnan-Shangrila area. In this study, the inhibitory spectrum of the selected strain was determined by Oxford cup double agar diffusion methodBacillussubtilis,Escherichiacoli,Staphylococcusaureusand Yeast was taken as the indicator, to screen out lactic acid bacteria with high antibacterial activity from various stains. At the same time, according to the exclusion of organic acids, hydrogen peroxide and proteolysis detection, speculated that the inhibitory effect of lactic acid bacteria may come from lactobacillin. The results showed that 3, 21, 23, 24, 25 strains have higher antibacterial activity. And 5 strains were identified by 16S rDNA sequence analysis. The 3, 23 and 24 asLactobacilluscasei, 21 asLactobacillusplantarum, 25 asLactococcuslactissubsp. lactis. Antibacterial spectrum test showed that lactobacillin could effectively inhibit some food-borne gram positive and negative bacteria. All isolated strains had no antimicrobial activity against fungi.

yak yogurt; Lactic acid bacteria; bacteriocin; strain screen; identification

國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(編號：201303085)；重慶市社會民生科技創(chuàng)新專項(編號：cstc2015shmszx80021)；重慶市特色食品工程技術研究中心能力提升項目(編號：cstc2014ptgc8001)；重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心建設項目(編號：167001);中央高?；緲I(yè)務費專項資金(編號：XDJK2017D122)

張梅梅，女，西南大學在讀碩士研究生。

索化夷 (1978—)，男，西南大學副教授，博士。 E-mail:birget@swu.edu.cn

2017—01—01

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.005