丁 瑩 雷小麗 孫 旦 李玉琴 儲(chǔ) 矗 陳正榮 季 偉 周衛(wèi)芳

蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（江蘇蘇州 215000）

肺炎支原體肺炎外周血miRNAs差異表達(dá)譜的篩選與驗(yàn)證

丁 瑩 雷小麗 孫 旦 李玉琴 儲(chǔ) 矗 陳正榮 季 偉 周衛(wèi)芳

蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（江蘇蘇州 215000）

目的篩選肺炎支原體肺炎（MPP）患兒差異表達(dá)的血漿miRNAs，并予以驗(yàn)證。方法入選36例MPP患兒，27例健康對(duì)照兒童；對(duì)3例MPP患兒及3例對(duì)照兒童的血漿樣本進(jìn)行miRNA芯片篩選，獲得miRNA表達(dá)譜；RT-qPCR法檢測(cè)全體研究對(duì)象外周血白細(xì)胞中miR-222-3p及miR-492的表達(dá)量并進(jìn)行比較。結(jié)果MPP患兒血漿中篩選出26條與對(duì)照組有顯著差異的miRNAs，其中19條miRNAs表達(dá)上調(diào)，7條miRNAs表達(dá)下調(diào)；與對(duì)照組比較，MPP組miR-222-3p及miR-492的表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論MPP患兒部分miRNAs表達(dá)有變化，可能參與MPP的免疫發(fā)病機(jī)制。

肺炎支原體肺炎； miRNA芯片； 兒童

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童呼吸道感染的常見(jiàn)病原體，近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道，重癥MP感染逐漸增多，除肺炎、胸腔積液、閉塞性毛細(xì)支氣管炎等肺內(nèi)表現(xiàn)外，少數(shù)可引起嚴(yán)重的肺外并發(fā)癥，如心肌炎、免疫性溶血性貧血、肝腎功能損害等[1-3]。MP感染的免疫發(fā)病機(jī)制是兒科界的研究熱點(diǎn)。MicroRNAs（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸、具有調(diào)控功能的非編碼RNA，miRNA參與各種生物學(xué)功能調(diào)控，在肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）患兒中的表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究篩選檢測(cè)MPP患兒外周血中的miRNA表達(dá)譜，檢測(cè)外周血miR-222-3p及miR-492的表達(dá)量驗(yàn)證芯片結(jié)果。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014年3月至2015年6月在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院確診為MPP的患兒36例。研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜14歲；②均有肺炎臨床特征，符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第7版診斷標(biāo)準(zhǔn)；③MP-DNA-PCR和MP-IgM均為陽(yáng)性；④通過(guò)鼻咽分泌物直接免疫熒光、PCR、血培養(yǎng)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)排除常見(jiàn)的病毒、衣原體、結(jié)核菌等呼吸道感染性疾病，以及支氣管肺發(fā)育畸形、免疫缺陷病等。

以同期健康體檢兒童27例作為正常對(duì)照組（NC組）。NC組入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡、性別與MPP組匹配；②無(wú)慢性器質(zhì)性疾?。虎?個(gè)月內(nèi)無(wú)急性感染性疾病史。

本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患兒家長(zhǎng)簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 MPP患兒入院后次日清晨、對(duì)照組體檢時(shí)空腹采集靜脈血2 mL，抗凝。于2 h內(nèi)4℃，2 500 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，吸取上層黃色血漿－80℃凍存。剩余血細(xì)胞按紅細(xì)胞裂解法分離獲得白細(xì)胞，加入1 mL TRIzol吹打混勻得到白細(xì)胞TRIzol混合液，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miRNA基因芯片篩選 選取3例MPP患兒和3例對(duì)照組兒童的血漿標(biāo)本送康成生物工程有限公司進(jìn)行高通量miRNA基因芯片檢測(cè)及篩選。冰上溶解血漿標(biāo)本，按照TRIzol試劑及miRNeasy mini試劑盒說(shuō)明書(shū)提取并純化血漿RNA。采用miRCURYTMArray Labelling 試劑盒進(jìn)行miRNA 標(biāo)記，miRCURYTMLNA Array芯片進(jìn)行miRNA雜交。雜交后用洗滌緩沖液試劑盒洗滌芯片數(shù)遍，1 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm）。芯片干燥后立即使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀進(jìn)行圖像掃描采集原始熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，采用GenePix pro V6.0進(jìn)行原始數(shù)據(jù)分析，篩選差異表達(dá)的miRNA并進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-222-3p及miR-492表達(dá) 36例MPP患兒及27例對(duì)照組兒童的白細(xì)胞TRIzol混合液冰上溶解，提取并純化RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度。miR-222-3p及miR-492以U6為內(nèi)參，按照miRNA/mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定樣本中miR-222-3p及miR-492的表達(dá)，采用相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt法比較各基因的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般情況

MPP組36例，男20例、女16例，中位年齡6.58歲（4.79～8.92歲）；NC組27例，男15例、女12例，中位年齡7.58歲（4.83～8.92歲）。兩組性別（χ2=0.00， P=1.000）、年齡（Z=0.67，P=0.510）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 MPP患兒血漿中差異表達(dá)的miRNA譜

原始熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后行t檢驗(yàn)，得到差異顯著性P值和標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)值的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）。miRNA表達(dá)上調(diào)：FC＞2.0且P＜0.05；miRNA表達(dá)下調(diào)：FC＜0.5且P＜0.05。MPP組外周血篩選出26條差異表達(dá)的miRNAs，其中19條miRNAs表達(dá)上調(diào)（包括miR-27a-3p、miR-424-5p、miR-146b-5p、miR-183-5p、miR-4456、miR-4513、miR-5008-3p、miR-1265、miR-936、miR-3156-3p、miR-222-3p、miR-4445-5p、miR-206、miR-4425、miR-3935、miR-4441、miR-4434、miR-4800-5p、miR-492），7條miRNAs表達(dá)下調(diào)（包括miR-1255b-2-3p、miR-5704、miR-4511、miR-4725-3p、miR-1184、miR-499a-3p、miR-4800-3p）。見(jiàn)表1。

2.3 miRNA的非監(jiān)督層次聚類(lèi)分析

對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類(lèi)分析，同一類(lèi)樣品能通過(guò)聚類(lèi)出現(xiàn)在同一簇中，聚在同一簇的miRNA可能具有相似的生物學(xué)功能，用熱圖展示（圖1）。圖中MPP組標(biāo)本標(biāo)記為29、47、49，NC組標(biāo)本標(biāo)記為2、7、8。

圖1 芯片結(jié)果中差異表達(dá)miRNAs的聚類(lèi)分析

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-222-3p 及miR-492表達(dá)

NC組miR-222-3p的表達(dá)水平為1.000±0.171，MPP組為1.886±0.300；與NC組比較，MPP組中miR-222-3p表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.79，P＜0.001）。NC組miR-492的表達(dá)水平為1.000±0.210，MPP組為2.052±0.497；與NC組比較，MPP組miR-492表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.25，P＜0.001）。

表1 MPP組與NC組miRNA差異篩選結(jié)果

3 討論

MP是兒童非典型性肺炎最常見(jiàn)的病原體，感染率隨年齡的增長(zhǎng)而遞增，6歲以上患兒肺炎支原體檢出率高達(dá)62%。MP每3～4年有一次大流行[4]。社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）中約40%是由MP感染引起，其中約18%需要住院治療[5]。支原體感染的既往研究以支原體耐藥、支原體感染后的氣道高反應(yīng)性及肺外損傷多見(jiàn)。

現(xiàn)今RNA 組學(xué)（包括mRNA、miRNA、piRNA、lncRNA 等）已成為研究熱點(diǎn)，除了蛋白編碼基因，非編碼RNA（如miRNA、lncRNA）在基因調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育等生命活動(dòng)中也同樣重要，在多個(gè)層面調(diào)節(jié)基因而發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。microRNAs（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸、具有調(diào)控功能的非編碼RNA，以堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與靶基因mRNA的3’-非編碼區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）特異性結(jié)合，降解或者阻遏靶mRNA的翻譯，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因翻譯的調(diào)節(jié)[6,7]。研究顯示，miRNA參與各種生物學(xué)功能調(diào)控，包括發(fā)育、增殖、凋亡、代謝等[6]，miRNA表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如腫瘤形成及耐藥、炎癥性疾病、感染性疾病等[8-11]。miRNA能夠在循環(huán)血液中檢測(cè)到，可作為某些疾病診斷和預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物[12]。

本研究應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)比較MPP組與NC組兒童外周血血漿中miRNA的表達(dá)譜，篩選出26條差異表達(dá)的miRNAs，其中19條miRNAs上調(diào)，7條miRNAs下調(diào)，提示miRNAs參與機(jī)體對(duì)肺炎支原體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。選擇miR-222-3p及miR-492作為研究對(duì)象，采用RT-qPCR方法驗(yàn)證了miR-222-3p及miR-492在MPP組中的高表達(dá)，與基因芯片結(jié)果相符，提示芯片篩選結(jié)果可靠。

目前關(guān)于miR-222-3p及miR-492的研究主要在腫瘤領(lǐng)域。在金黃色葡萄球菌腸毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）誘導(dǎo)形成的小鼠急性肺損傷模型中，肺部單核細(xì)胞的多個(gè)miRNA表達(dá)升高，包括miRNA-222[13]；而經(jīng)3,3'-二吲哚甲烷（DIM）預(yù)處理的小鼠肺部炎癥、血管滲漏和IFN-γ分泌均減弱，且小鼠肺部的單核細(xì)胞miRNAs（包括miR-222）表達(dá)譜發(fā)生改變，研究首次證明DIM可以改善SEB誘導(dǎo)的急性肺損傷，可能是通過(guò)調(diào)控包括miR-222在內(nèi)的miRNAs發(fā)揮作用[14]。在腫瘤以外的研究證實(shí)，miRNA-492參與高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗和血管內(nèi)皮功能障礙[15]及具有潛在的抗血管生成作用，其有望成為抗血管增生治療的有效手段[16]。本實(shí)驗(yàn)為這些差異表達(dá)的miRNAs所調(diào)控的靶基因參與肺炎支原體肺炎發(fā)病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

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Expression and veri fi cation of miRNAs in peripheral blood of Mycoplasma pneumoniae pneumonia

DING Ying, LEI Xiaoli, SUN Dan, LI Yuqin, CHU Chu, CHEN Zhengrong, JI Wei, ZHOU Weifang（Children’s Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu, China）

ObjectiveTo identify the differentially expressed microRNAs（miRNA）in plasma of Mycoplasma pneumoniae pneumonia (MPP) by miRNA microarray.Methods36 cases of hospitalized children with MPP were enrolled (MPP group).27 cases of healthy children were enrolled as control group (NC group) in the same period.Microarray chip was used to fi nd out differentially expressed miRNAs of plasma from 3 cases with MPP group and 3 cases with NC group.Real-time quantitative PCR was chosen to detect the expression of miR-222-3p and miR-492 in leukocytes from MPP group (n=36) and NC group (n=27).Results26 miRNAs differentially expressed between the two groups were screened out by miRNA microarray assays, of which the expression of 19 miRNAs was elevated, while 7 miRNAs declined.Compared with NC group, the expression of miR-222-3p and miR-492 increased in the MPP group (P＜0.01).ConclusionsSome miRNAs are differently expressed in peripheral blood of MPP patients, which may be involved in the immunopathogenesis of MPP.

Mycoplasma pneumoniae pneumonia; miRNA microarray; child

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.02.003

2016-07-14)

(本文編輯：蔡虹蔚)

蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.SS201535）

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