段強(qiáng)德,許保疆,王錄軍,付宏岐,朱國強(qiáng)

(1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西 渭南714026; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002; 3.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州225009)

FimH黏附素對(duì)F18ac+大腸桿菌黏附能力和生物被膜形成能力的影響

段強(qiáng)德1,許保疆2,王錄軍1,付宏岐1,朱國強(qiáng)3

(1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西 渭南714026; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002; 3.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州225009)

為研究Ⅰ型菌毛FimH黏附素在F18ac+大腸桿菌(F18ac+E.coli)致病機(jī)制中的作用，采用λ-Red同源重組方法成功構(gòu)建了F18ac+E.coli的fimH基因缺失株(F18ac△fimH)。并使用體外仔豬上皮細(xì)胞感染模型，探討FimH黏附素缺失后對(duì)F18ac+E.coli黏附能力和體外生物被膜形成能力的影響。結(jié)果表明，與野生株相比，F(xiàn)18ac△fimH缺失株對(duì)易感仔豬上皮細(xì)胞系IPEC-1和IPEC-J2的黏附能力和體外生物被膜形成能力均顯著下降，且其黏附能力可被8%的D-甘露糖所抑制。但是F18ac△fimH/pfimH回補(bǔ)株的黏附能力以及生物被膜形成能力均基本恢復(fù)至野生株水平?？梢?，F(xiàn)imH黏附素是介導(dǎo)F18ac+E.coli黏附的重要黏附因子。

F18ac+大腸桿菌； Ⅰ型菌毛； FimH黏附素； 黏附； 生物被膜

F18+大腸桿菌(F18+E.coli)根據(jù)其表達(dá)菌毛類型的不同，可以分為F18ab和F18ac變異種。F18ab+E.coli屬于產(chǎn)志賀氏樣毒素的E.coli(shiga-like toxicE.coli， SLTEC)，主要引起仔豬水腫病(edema disease，ED)；F18ac+E.coli屬于產(chǎn)腸毒素性E.coli(enterotoxigenicE.coli，ETEC)，是引起斷奶仔豬腹瀉(post-weaning diarrhea,PWD)的主要病原菌之一[1-2]。F18ac+E.coli在多種黏附因子介導(dǎo)下，首先粘附定植到仔豬小腸上皮細(xì)胞，然后通過分泌毒素引起機(jī)體水、電解質(zhì)紊亂而最終導(dǎo)致腹瀉。目前,已知參與介導(dǎo)F18ac+E.coli對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞的黏附因子有F18ac菌毛和鞭毛[3-4]。另外，潛在的黏附因子包括與擴(kuò)散粘附有關(guān)的黏附素(adhesin involved in diffuse adherence,AIDA-I)[5]和Ⅰ型菌毛，但它們?cè)贔18ac+E.coli黏附過程中的作用仍然不清楚。

Ⅰ型菌毛在病原性大腸桿菌中廣泛表達(dá)，并作為主要的黏附因子發(fā)揮毒力作用。Ⅰ型菌毛的骨架由約3 000個(gè)重復(fù)的fimA亞基構(gòu)成，但是其黏附性能則取決于位于菌毛頂部的具有凝集素特性的fimH亞基。FimH黏附素包括凝集素結(jié)構(gòu)域和菌毛結(jié)構(gòu)域，相互之間由1個(gè)短的四肽環(huán)連接。FimH黏附素介導(dǎo)多種致病菌與宿主細(xì)胞的黏附，包括尿道致病性大腸桿菌(uropathogenicE.coli，UPEC)、黏附侵襲性大腸桿菌(adherent-invasiveE.coli,AIEC)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)等[6-8]。FimH黏附素通過與宿主細(xì)胞表面的D-甘露糖受體結(jié)合介導(dǎo)病原菌的黏附。盡管已知Ⅰ型菌毛在多方面參與了多種病原菌的致病過程，但其是否參與F18ac+E.coli的黏附過程還不清楚。為此，通過比較F18ac+E.coli野生株和F18ac△fimH缺失株對(duì)易感仔豬上皮細(xì)胞系IPEC-1和IPEC-J2黏附能力的變化，探討FimH黏附素在F18ac+E.coli黏附過程中的作用，旨在為研究F18ac+E.coli致病機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞系

F18ac+E.coli標(biāo)準(zhǔn)株(O157:H19:F18ac,4P-,STa+,STb+)和pBR322表達(dá)載體均由渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。λ-Red同源重組所需質(zhì)粒pKD46、pKD3和Pcp20均系美國賓夕法尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。仔豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-1和IPEC-J2由美國堪薩斯州立大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 缺失突變株及互補(bǔ)株的構(gòu)建

F18ac△fimH缺失株根據(jù)Datsenko等[9]的λ-Red同源重組技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。首先以質(zhì)粒pKD3為模板，利用引物F18ac△fimH-F/F18ac△fimH-R (表1)擴(kuò)增，將純化好的帶有fimH基因同源臂的氯霉素抗性基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至攜帶有質(zhì)粒 pKD46的F18ac+E.coli感受態(tài)細(xì)胞，在Red同源重組酶的作用下，借助兩端與靶基因兩翼同源的序列與染色體上對(duì)應(yīng)區(qū)域發(fā)生同源重組，實(shí)現(xiàn)一步法構(gòu)建F18ac△fimH::Cat。2次重組中利用溫度敏感性，編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，消除Cat抗性基因標(biāo)志。通過PCR鑒定(PBR-fimH-F/PBR-fimH-R，表1)及DNA測(cè)序結(jié)果確定缺失株是否成功構(gòu)建。

表1 PCR引物寡核苷酸序列和擴(kuò)增片段長度

注：下劃線為fimH基因序列。

以F18ac+E.coli野生株基因組DNA為模板，PBR-fimH-F和PBR-fimH-F為引物(表1)PCR擴(kuò)增fimH全長基因，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后克隆至表達(dá)載體pBR322中，進(jìn)一步將重組質(zhì)粒pBR322-fimH轉(zhuǎn)化到F18ac△fimH缺失株中，獲得攜帶fimH基因的回補(bǔ)株，并命名為F18ac△fimH/pfimH。

1.3 生物學(xué)特性的測(cè)定

將F18ac+E.coli野生株、F18ac△fimH缺失株以及F18ac△fimH/pfimH回補(bǔ)株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第2天按1︰50比例轉(zhuǎn)接于10 mL新鮮LB培養(yǎng)液中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取樣測(cè)定1次OD600值，記錄并重復(fù)上述試驗(yàn)4次，繪制生長曲線。

血凝試驗(yàn) (hemagglutination，HA)和甘露糖敏感性血凝試驗(yàn)(mannose-sensitive hemagglutinin，MSHA)參照Allan等[10]的方法進(jìn)行，酵母凝集試驗(yàn)和凝集抑制試驗(yàn)參照Sokurenko等[11]的方法進(jìn)行。

1.4 黏附試驗(yàn)與黏附抑制試驗(yàn)

黏附試驗(yàn)按照 Duan等[3]的方法進(jìn)行，將對(duì)數(shù)期生長的細(xì)菌按20︰1的比例加至在48孔板中已經(jīng)生長好的IPEC-1或IPEC-J2單層細(xì)胞，并于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中共孵育1 h,然后將未與細(xì)胞黏附的細(xì)菌用PBS洗滌去掉。與細(xì)胞表面黏附的細(xì)菌則用0.5%的Triton X-100裂解，然后按1︰10的比例進(jìn)行梯度稀釋涂布LB平板進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)。

黏附抑制試驗(yàn)中，先用8%D-甘露糖重懸F18ac+E.coli野生菌株，再以20︰1的比例加入IPEC-1或IPEC-J2單層細(xì)胞共孵育1 h，細(xì)胞黏附細(xì)菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法同上。試驗(yàn)均重復(fù)4次，每次試驗(yàn)每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行孔。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Student’st-test軟件。

1.5 生物被膜定量檢測(cè)

將在30 ℃用LB培養(yǎng)的過夜菌液按1︰100的比例接種BF誘導(dǎo)培養(yǎng)基，再加入96孔板中，每孔150 μL。將96孔板置于30 ℃恒溫?fù)u床(80 r/min)中培養(yǎng)24 h，棄菌液后，用蒸餾水將未附著的細(xì)菌充分洗滌干凈，以2%的結(jié)晶紫于室溫染色15 min，用蒸餾水沖洗干凈后，每孔加入200 μL 95%乙醇溶解結(jié)晶紫，采用酶標(biāo)儀讀取其OD600值。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)樣品設(shè)置7個(gè)平行孔。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Student’st-test軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 △fimH缺失株的構(gòu)建

分別以F18ac+E.coli野生株、1次重組株和2次重組株基因組為模板，用鑒定引物PBR-fimH-F和PBR-fimH-R(表1)PCR擴(kuò)增fimH基因。對(duì)照野生株擴(kuò)增片段的長度為 903 bp，1次重組體和2次重組體長度分別為1 353 bp和425 bp(圖1)，結(jié)果均與預(yù)期相同。2次重組株測(cè)序結(jié)果表明,fimH基因中霉素抗性基因Cat已丟失，在同源區(qū)內(nèi)只留下1個(gè)FRT位點(diǎn)。

M: DNA Marker；1.F18ac+E.coli野生株；2.F18ac△fimH::Cat 1次重組體；3.F18ac△fimH 2次重組體；4.F18ac△fimH/pfimH回補(bǔ)株

2.2fimH基因缺失不影響F18ac+E.coli的生物學(xué)特性

從圖 2可以看出，F(xiàn)18ac+E.coli野生株、F18ac△fimH缺失株和F18ac△fimH/pfimH回補(bǔ)株在各個(gè)生長時(shí)期的生長曲線基本一致，表明fimH基因缺失不影響F18ac+E.coli的生長。

圖2 F18ac+E.coli生長曲線

FimH凝集素能夠與動(dòng)物的紅細(xì)胞和酵母細(xì)胞發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，并且該凝集現(xiàn)象能夠被8%的D-甘露糖抑制。F18ac+E.coli野生株能夠與2%豬血紅細(xì)胞和酵母細(xì)胞凝集，呈細(xì)小的顆粒狀或大塊的片狀，F(xiàn)18ac△fimH缺失株則對(duì)2%豬血紅細(xì)胞和酵母細(xì)胞均無凝集現(xiàn)象，而回補(bǔ)株的凝集能力得到恢復(fù)。

2.3 FimH黏附素促進(jìn)F18ac+E.coli的黏附

F18ac+E.coli對(duì)新生仔豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-1和IPEC-J2均具有很好的黏附能力。與野生株相比，F(xiàn)18ac△fimH缺失株對(duì)上述2個(gè)細(xì)胞系的黏附能力均顯著下降。其中，F(xiàn)18ac△fimH缺失株對(duì)IPEC-1細(xì)胞的黏附能力僅為野生株黏附能力的57%(圖3)，對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力則僅為野生株黏附能力的36%(圖4)。F18ac△fimH/pfimH回補(bǔ)株的黏附能力則恢復(fù)至野生株水平。在黏附抑制試驗(yàn)中，8% D-甘露糖能顯著抑制F18ac+E.coli對(duì)IPEC-1和IPEC-J2細(xì)胞的黏附(圖3、4)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)imH黏附素是F18ac+E.coli重要的黏附因子。

*代表與野生株相比差異顯著(P≤0.05)，下圖同

圖4 IPEC-J2細(xì)胞黏附結(jié)果

2.4 FimH黏附素促進(jìn)F18ac+E.coli體外生物被膜的形成

生物被膜定量檢測(cè)結(jié)果表明，與野生株相比，△fimH缺失株形成生物被膜的能力顯著下降，OD600分別為0.360和0.248，同樣當(dāng)生物被膜誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入8%的D-甘露糖后，能顯著抑制F18ac+E.coli體外生物被膜的形成。在F18ac△fimH/pfimH回補(bǔ)株中，生物被膜形成能力恢復(fù)到了野生株約90%的水平(OD600為0.328)(圖 5)。

圖5 生物被膜定量檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

FimH黏附素通過與宿主上皮細(xì)胞表面的甘露糖受體結(jié)合而介導(dǎo)細(xì)菌的黏附，因此，該黏附過程能被外源性的D-甘露糖所抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)基中添加8%的D-甘露糖時(shí)，F(xiàn)18ac+E.coli與IPEC-1和IPEC-J2細(xì)胞的黏附均被顯著抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與野生菌株相比，F(xiàn)18ac△fimH基因缺失株對(duì)IPEC-1和IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力均顯著下降，而F18ac△fimH/pfimH回補(bǔ)株的黏附能力可恢復(fù)至野生株水平。F18ac菌毛和鞭毛是F18ac+E.coli重要的黏附因子[3-4]，所以，F(xiàn)imH黏附素缺失后并沒有完全廢除其黏附能力。上述結(jié)果表明，F(xiàn)imH黏附素在F18ac+E.coli黏附過程中發(fā)揮了重要的作用，是其重要的黏附因子之一。

越來越多的證據(jù)表明，Ⅰ型菌毛在生物被膜形成過程中發(fā)揮著重要的作用[8,12]。與F18ac+E.coli野生株相比，F(xiàn)18ac△fimH基因缺失株形成生物被膜的能力明顯減弱。此外，當(dāng)生物被膜誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加8%的D-甘露糖時(shí)，野生株形成生物被膜的能力同樣能被抑制，這表明，F(xiàn)imH黏附素是F18ac+E.coli體外生物被膜形成的重要影響因素。

綜上，Ⅰ型菌毛的FimH黏附素在F18ac+E.coli的黏附和體外生物被膜形成過程中發(fā)揮著重要的作用，這有利于進(jìn)一步加深對(duì)F18ac+E.coli引起PWD致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為研制預(yù)防F18ac+E.coli感染的多價(jià)疫苗提供了新的策略。

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FimH Adhesins Contribute to F18ac+E.coliAdhesion and Biofilm FormationinVitro

DUAN Qiangde1,XU Baojiang2,WANG Lujun1,FU Hongqi1,ZHU Guoqiang3

(1.Weinan Vocational and Technical College,Weinan 714026,China; 2.Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

In order to investigate the role of fimH adhesins in the pathogenesis of F18ac+E.coli,F18ac△fimH isogenic mutant was generated by λ Red-based homologous recombination system.The adhesion and biofilm(BF) formation ability of F18ac△fimH mutant and wild-type strains were compared using aninvitropiglet epithelial cell infection model.In theinvitrobacterial adherence assay,our results showed that the isogenic F18ac△fimH mutant correlated with the significantly decreased adhesion to both porcine epithelial IPEC-1 and IPEC-J2 cells when compared with the F18ac+E.coliwild-type strains.In addition,the adherence of F18ac+E.colito these cell lines was also blocked by 8% D-mannose in the cell culture medium.In consistent with less adherence ability,the F18ac△fimH mutant also reduced their ability to form biofilm.These results indicated that fimH adhesins of type Ⅰ fimbriae play an important in F18ac+E.coliadhesion.

F18ac+E.coli; type Ⅰ fimbriae; FimH adhesins; adherence; biofilm

2016-10-20

渭南市科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2013KYJ-3);陜西省科技新星項(xiàng)目(2015KJXX-97)

段強(qiáng)德(1983-)，男，湖南衡陽人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物基因疫苗的開發(fā)。E-mail:dqd8358@163.com

S852.61

A

1004-3268(2017)03-0134-04