劉 杰，劉維康

(河南省洛陽(yáng)市普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000）

一例豬肺炎鏈球菌病的診斷與防治

劉 杰，劉維康

(河南省洛陽(yáng)市普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽(yáng) 471000）

肺炎鏈球菌又稱肺炎球菌為鏈球菌屬一員，主要寄生在人和動(dòng)物的呼吸道中，豬肺炎鏈球菌病的主要癥狀為幼畜出現(xiàn)敗血癥和大葉性肺炎及腦膜炎等；在臨床診斷中發(fā)現(xiàn)疑似病例，并在實(shí)驗(yàn)室診斷中分離到一株疑似菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化及分子鑒定確定為肺炎鏈球菌；藥敏試驗(yàn)結(jié)果為病原菌對(duì)頭孢噻呋、左氧氟沙星、桿菌肽、阿米卡星高度敏感，對(duì)甲氧芐啶、卡那霉素、甲砜霉素、鹽酸克林霉素、鹽酸林可霉素、慶大霉素不敏感。

豬肺炎鏈球菌；生化鑒定；PCR鑒定；藥敏試驗(yàn)

2016年11月河南某豬場(chǎng)剛斷奶仔豬發(fā)生以咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱為主要特征的傳染病。通過(guò)對(duì)病豬進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)病死豬氣管內(nèi)充滿泡沫狀分泌物，肺呈大葉性肺炎變化，有不同程度病變，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷確定為豬肺炎鏈球菌。

1 材料與方法

1.1 組織

無(wú)菌采集發(fā)病仔豬的肺臟。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基和MH培養(yǎng)基，由青島海博試劑有限公司提供；革蘭氏染色試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；細(xì)菌微量生化管及藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

圖1 肺炎球菌菌落形態(tài)

表1 生化鑒定結(jié)果

圖2 分子鑒定結(jié)果

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

按照配方稱取足量哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加相應(yīng)的純化水配制100 mL培養(yǎng)基，121 ℃，滅菌15 min，滅菌結(jié)束后待培養(yǎng)基溫度降至50 ℃左右，加入5 mL的綿羊血，搖勻，制成血平皿。

1.3.2 細(xì)菌分離

無(wú)菌取肺臟病變組織觸片染色鏡檢，并接種于血培養(yǎng)基上， 37 ℃，培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.3.3 生化鑒定

挑取疑似單個(gè)菌落接種于微量生化管，進(jìn)行相應(yīng)的生化鑒定。

1.3.4 分子鑒定

針對(duì)鏈球菌延伸因子EF-Tu基因，杜海燕等[1]設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，序列為：P1：5’-GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC-3’/ P2：5’-ACGTTCGATTTCATCACGTT-3’擴(kuò)增的目的片段大小為197 bp，有寶生物工程（大連）有限公司合成。

采用25μL反應(yīng)體系，即10×PCR Buffer2.5μL、dNTP 2.0μL、DNA Taq酶0.5μL，P1/P2引物各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH2O 16.0μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃5 min，95 ℃1 min，59 ℃1 min，72 ℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.5 藥敏試驗(yàn)

挑取疑似單個(gè)菌落接種于10 mLTSB血清培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)5～6 h，取100μL均勻涂布于MH培養(yǎng)基上。用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）[2]，按使用說(shuō)明書將藥敏片均勻放置在其上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據(jù)說(shuō)明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株的藥敏性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

取肺臟病變組織進(jìn)行觸片革蘭氏染色鏡檢，可見(jiàn)有橢圓形單個(gè)細(xì)菌存在。菌落在血平皿上呈β溶血，革蘭氏染色為陽(yáng)性球菌，菌落表面凹陷呈臍狀，如圖1。

2.2 生化鑒定結(jié)果

生化鑒定結(jié)果如表1。

2.3 分子鑒定結(jié)果

取單個(gè)純化且具有典型特點(diǎn)的菌落進(jìn)行PCR鑒定，并設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，根據(jù)結(jié)果可判定為鏈球菌，結(jié)果如圖2。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上結(jié)果，選取藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表2。

3 討論

肺炎鏈球菌又稱肺炎球菌為鏈球菌屬一員，在自然界中分布非常廣泛[3]，主要寄生在人和動(dòng)物的呼吸道中，當(dāng)某些原因使機(jī)體抵抗力下降時(shí)，可引起人和動(dòng)物的內(nèi)源性感染，也可發(fā)生外源性感染，主要引起幼畜敗血癥和大葉性肺炎及腦膜炎等。

豬肺炎鏈球菌病的臨床癥狀與常見(jiàn)的呼吸道疾病相似[4]，較難進(jìn)行區(qū)分，且病原差異較大，用藥方向有別。豬場(chǎng)發(fā)病后，一般常診斷為豬藍(lán)耳病、豬傳染性接觸性胸膜肺炎或豬肺疫等，易出現(xiàn)誤診，造成重大損失。

引發(fā)豬肺炎鏈球菌病主要與飼養(yǎng)管理水平密切相關(guān)，由于管理不科學(xué)，造成豬本身抵抗力不強(qiáng)，主要誘因是通風(fēng)不良、氨氣濃度過(guò)高等，另外本病還會(huì)引起繼發(fā)感染，造成較大損失[5]。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)科學(xué)管理和飼養(yǎng)，提高機(jī)體抵抗力，另外要接受該病原菌在環(huán)境中大量存在的現(xiàn)實(shí)，定期進(jìn)行環(huán)境衛(wèi)生消毒。

[1] 杜海燕，李基棕，周碧君，等. 鏈球菌通用PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（12）：152-154.

[2] 譚瑤，趙清，舒為群，等. K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010（20）：2290-2291.

[3] 曲哲會(huì)，郭曉秋. 豬肺炎球菌病的診斷與治療[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010（4）：119.

[4] 邰振國(guó).豬的肺炎球菌病[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，1998（3）：42.

[5] 黃鑒明，向陽(yáng)，向明，等. 豬肺炎球菌病的診治[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（1）：65.

2016-12-12）