宋倩倩，張金枝，蔣 梅，徐寧迎

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058)

試驗(yàn)研究

金華豬MYLPF基因克隆與序列分析

宋倩倩，張金枝，蔣 梅，徐寧迎

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058)

研究采用Trizol試劑提取70日齡金華豬肝臟組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增MYLPF基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，將純化的目的片段與pClone007載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆并測(cè)序，然后利用生物信息學(xué)軟件分析其序列特征，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，金華豬MYLPF基因的cDNA核苷酸序列、RT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為611 bp，重組后的質(zhì)粒長(zhǎng)度為756 bp，編碼169個(gè)氨基酸，同源性分析表明，與大白豬的MYLPF 氨基酸序列完全相同。MYLPF分子進(jìn)化樹表明金華豬與雞和斑馬魚的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與大白豬的親緣關(guān)系最為接近。

MYLPF基因；克隆測(cè)序；金華豬

快肌肌球蛋白可磷酸化調(diào)節(jié)輕鏈(MYLPF)是一種肌漿球蛋白，存在種間差異。王娟等(2010)[1]通過對(duì)黏斑信號(hào)通路的研究，發(fā)現(xiàn)MYLPF參與細(xì)胞骨架的組成及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。肌球蛋白輕鏈激酶通過磷酸化作用和Ca2+結(jié)合可調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈細(xì)肌絲的活性[2-4]。研究證實(shí)，MYLPF基因作為肌球蛋白輕鏈基因之一, 與豬的屠宰率、肌肉系水力、肉色和肌內(nèi)脂肪存在一定的相關(guān)性，是重要的肉質(zhì)基因，影響著豬的多種經(jīng)濟(jì)性狀，因此對(duì)肉質(zhì)改善具有重要影響[5-6]。

金華豬作為我國(guó)著名的優(yōu)良地方豬種之一，具有肉質(zhì)優(yōu)良、肉味鮮美，后腿腌制成的“金華火腿”，質(zhì)佳味香，外型美觀，蜚聲中外[7-8]，開展金華豬肉質(zhì)相關(guān)基因(如MYLPF基因)研究，有利于金華豬種質(zhì)資源的開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 70日齡金華豬，由金華家農(nóng)兩頭烏種豬場(chǎng)提供，屠宰后，取其肝臟，液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 Trizol試劑、質(zhì)粒小提試劑盒(No.DP103)、DH5α感受態(tài)細(xì)胞(No.CB101)、DL2000 Marker購(gòu)自北京某生化科技有限公司；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(No.DRR037A) 、EX Taq(No.DR001A)、Gel Extraction Kit(膠回收試劑盒)購(gòu)自大連某生物工程有限公司。特異性引物、載體通用引物及pClone007 Vector載體由杭州某生物技術(shù)有限公司提供，-20℃保存。

1.3 RNA提取 采用Trizol試劑提取金華豬肝臟組織的總RNA，取綠豆樣大小的肝臟組織置于加有鋼珠及添加Trizol試劑1 mL的離心管中，將離心管置于研磨儀中(頻率70 Hz，時(shí)間90 s),研磨后靜置10 min；再加入氯仿200 μL，混勻后靜置15 min；然后在4 ℃，12000 r/min下離心15 min，取上清液置于新的離心管中，再加入異丙醇500 μL，混勻后靜置10 min，然后在4 ℃，12000 r/min下離心10 min，棄上清，加入75%酒精1 mL進(jìn)行洗滌，混勻后靜置2 min，然后在4 ℃，7500 r/min下離心5 min，棄上清，晾干酒精后加入DNase/RNase-Free ddH2O 50 μL，RNA濃度及純度(OD260/OD280)用核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定(Nano Drop 2000)。余下樣品-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 cDNA合成 采用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。cDNA合成按下列組份配制RT反應(yīng)液(反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行)，基因組DNA 的除去反應(yīng)：5×g DNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1.0 μg，RNase Free dH2O加至10.0 μL，在42 ℃放置2 min。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：5×Prime Script Buffer 4.0 μL，Prime Script RT Enzyme MixⅠ 1.0 μL，RT Prime Mix 1.0 μL,再加入基因組DNA除去反應(yīng)的反應(yīng)液10.0 μL,RNase Free dH2O 加至20.0 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85 ℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank中豬MYLPF基因的mRNA序列(NM_001006592)，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由杭州某生物技術(shù)有限公司合成?；蛞颋1:5′-TTTTCCCAG CCAGAGCCACT-3′, R1:5′-TCAATTTATTAGGAAAC GAGCCAGG-3′，M13載體引物F：5′-TGTAAAACGA CGGCCAGT-3′，R:5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′。

1.6 PCR擴(kuò)增與克隆 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50 μL，其中金牌mix為45 μL、F/R primers各2 μL，模板cDNA為1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s；63 ℃退火20 s；72 ℃延伸10 s；最后72 ℃延伸1 min，循環(huán)數(shù)為30。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶用Gel Extraction Kit試劑盒純化回收，回收后的PCR產(chǎn)物一部分直接送杭州某生物技術(shù)有限公司測(cè)序，其余部分純化后的PCR產(chǎn)物與pClone007 Vector載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽(yáng)性克隆送杭州某生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 采用Trizol試劑提取金華豬肝臟組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，RT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為611 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(詳見圖1)。

圖1 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果(M：DL2000，1,2)

2.2 重組質(zhì)粒電泳圖 經(jīng)純化回收后的金華豬RT-PCR產(chǎn)物，利用M13引物與pClone007載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有目的片段的質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示重組后的質(zhì)粒長(zhǎng)度為756 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(詳見圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果(M：DL2000，2)

2.3 金華豬MYLPF基因序列分析比對(duì) 利用DNAman、Primer等多個(gè)生物學(xué)信息軟件可以獲得金華豬MYLPF 基因cDNA 序列編碼的169個(gè)氨基酸(圖3)。與NCBI網(wǎng)站BLAST后下載的人(NM_001324458.1)、大白豬(NM_001006592.1)、黑猩猩(XM_016928813.1)、小鼠(NM_012605.2)、大鼠(NM_016754.5)、山羊(NM_001285754.1)、綿羊(NM_001145183.1)、兔子(NM_001082761.1)、牛(NM_001075647.1)、雞(NM_001198744.1)、馬(XM_001496195.4)、斑馬魚(XM_004552448.3)等物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，相似性分別為96%、100%、96%、99%、99%、98%、98%、98%、98%、90%、98%、82%。

2.4 金華豬MYLPF基因進(jìn)化樹 利用MEGA5.10軟件將金華豬MYLPF氨基酸序列與人、大白豬、黑猩猩、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、兔子、牛、雞、馬、斑馬魚等物種的MYLPF氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，金華豬MYLPF基因與雞和斑馬魚親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他10個(gè)物種較為接近，其中與大白豬的親緣關(guān)系最為接近(詳見圖4)。

圖3 金華豬MYLPF基因推導(dǎo)蛋白氨基酸序列

圖4 MYLPF分子系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 小結(jié)與討論

MYLPF基因是由160個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白，也是骨骼肌分化與生長(zhǎng)的重要基因之一，對(duì)豬肉品質(zhì)也有一定的影響[9]。本研究獲得的金華豬MYLPF基因cDNA序列全長(zhǎng)611 bp，重組后的質(zhì)粒長(zhǎng)度為756 bp，編碼169個(gè)氨基酸。比天府肉羊的MYLPF基因cDNA和氨基酸序列分別少了5 bp和1個(gè)氨基酸，這可能與品種間差異有關(guān)[10]。

徐德全等(2005)[11]應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)篩選出了豬MYLPF基因，研究了該基因的第5內(nèi)含子多態(tài)性，結(jié)果表明該多態(tài)性與豬的胴體性狀和肉質(zhì)性狀具有相關(guān)性，預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列與人、小鼠和大鼠的同源性都在96%以上。本研究的同源性分析表明，金華豬與大白豬的MYLPF 氨基酸序列完全相同，與其它哺乳類動(dòng)物的MYLPF 氨基酸序列相似性均在96%以上，研究表明金華豬與其它11個(gè)物種氨基酸序列間具有較高的保守性。

分子進(jìn)化樹表明，金華豬MYLPF基因與雞和斑馬魚親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過DNAman軟件分析，發(fā)現(xiàn)金華豬與大白豬的MYLPF基因核苷酸序列相似性達(dá)99.8%，僅有一個(gè)核苷酸差異，但并不影響氨基酸序列，從而表明MYLPF基因不是影響金華豬與大白豬肉質(zhì)差異的主要基因。

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2016-11-30

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No.2015BAD03B01)、金華市農(nóng)業(yè)局金華兩頭烏豬科技創(chuàng)新利用項(xiàng)目

S828.2

A

1005-7307(2017)02-0001-003