陳進(jìn)斌+蘭書(shū)煥+李旭東

摘要 從畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)、堆肥場(chǎng)、魚(yú)塘等場(chǎng)所分離篩選除臭功能菌，獲得6株具有顯著除臭作用的微生物，分別為酵母菌Y-1、霉菌M-1、乳酸菌L-1、芽孢桿菌B-1和B-2、光合菌P-1。采用正交試驗(yàn)對(duì)功能菌進(jìn)行優(yōu)化組合，研制除臭復(fù)合菌劑。結(jié)果表明：Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1的最優(yōu)比例為1∶1∶1∶1∶3∶3，其對(duì)綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的平均去除率分別為54.97%、18.66%、13.12%、41.18%，對(duì)綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的最大去除率分別為72.95%、35.26%、20.20%、81.28%。復(fù)合菌劑能夠明顯減少豬糞中惡臭的產(chǎn)生量。

關(guān)鍵詞 豬糞；生物除臭；綜合惡臭；菌劑

中圖分類號(hào) X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）23-0172-03

Abstract Six microorganisms with high deodorization efficiency were isolated from livestock farm，compost site and fish pond，which were identified as yeast Y-1，mould M-1，lactobacillus L-1，bacillus B-1 and B-2 and photosynthetic bacteria P-1，respectively.The six strains were made into complex microbial agent，the combination ratio was optimized by orthogonal array design.The results showed that the optimal ratio of Y-1，M-1，L-1，B-1，B-2 and P-1 was 1∶1∶1∶1∶3∶3.In the deodorization of swine manure，the average reduction rate on odor intensity，TVOC，NH3 and H2S was 54.97%，18.66%，13.12%，41.18%，respectively，and the maximum reduction rate of that was 72.95%，35.26%，20.20%，81.28%，respectively.In conclusion，addition of microbial agent can significantly reduce the odor pollutants produced by swine manure.

Key words swine manure；biological deodorization；odor intensity；microbial agent

改革開(kāi)放以來(lái)，我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)得到了大發(fā)展，曾創(chuàng)造了20年連增的奇跡，年均增幅逾10%。然而，畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的環(huán)境污染對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響也日趨嚴(yán)重[1-2]。其中，畜禽糞便產(chǎn)生的惡臭污染也是重要的環(huán)境污染之一。畜禽糞便中含有氨、硫化氫等有害氣體，若未能及時(shí)清除或處理，將產(chǎn)生甲基硫醇、二甲二硫醚、甲硫醚及多種低級(jí)脂肪酸等惡臭氣體，導(dǎo)致臭味成倍增加。這不僅影響了養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)畜禽的生長(zhǎng)，而且也會(huì)對(duì)周圍居民的身體健康產(chǎn)生威脅[3]。因此，開(kāi)展除臭研究對(duì)畜禽糞便惡臭污染控制和管理具有重要意義[4]。

當(dāng)前，在畜禽養(yǎng)殖除臭中，生物除臭是研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)生物除臭的研究多集中在生物濾池或生物滴濾塔除臭，如劉春敬通過(guò)構(gòu)建高效生物除臭滴濾塔將臭味去除，其對(duì)H2S的去除率達(dá)90%[5]。由于這種除臭技術(shù)成本相對(duì)較高，在養(yǎng)殖場(chǎng)局部場(chǎng)所如堆肥場(chǎng)可采用，但對(duì)于受糞污污染的圈舍等場(chǎng)所因其面積大而難以大規(guī)模應(yīng)用。因此，采用復(fù)合菌劑原位除臭是研究重點(diǎn)，目前應(yīng)用最為廣泛的除臭菌劑是日本EM（有效微生物）菌劑，其利用光合菌類、乳酸菌類、酵母菌類、絲狀菌類和革蘭氏陽(yáng)性菌類等菌株來(lái)抑制惡臭物質(zhì)的產(chǎn)生或分解惡臭物質(zhì)，達(dá)到除臭效果[6]。但由于EM菌的廣譜性，其在畜禽糞便除臭中的應(yīng)用效果并不是十分理想。因此，研制對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)圈舍面源惡臭污染有針對(duì)性的復(fù)合菌劑尤為重要。本文則以養(yǎng)豬場(chǎng)圈舍面源惡臭污染治理為切入點(diǎn)，篩選出幾株具有顯著除臭作用的微生物，按照其功能及微生物之間的協(xié)同作用進(jìn)行組合，研制高效除臭菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株。在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)、堆肥場(chǎng)、魚(yú)塘等場(chǎng)所采樣，實(shí)驗(yàn)室分離篩選到酵母菌、霉菌、乳酸菌、芽孢桿菌和光合菌。

1.1.2 糞樣。試驗(yàn)所用糞樣為取自四川省雙流縣富源養(yǎng)殖場(chǎng)的新鮮豬糞。

1.1.3 分離培養(yǎng)基。酵母菌：YPD培養(yǎng)基。霉菌：加入20～30 mg/L鏈霉素的PDA培養(yǎng)基。乳酸菌：MRS培養(yǎng)基。芽孢桿菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。光合菌：①富集培養(yǎng)基。通威光合菌分離用培養(yǎng)基10 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.8；②雙層培養(yǎng)基下層。通威光合菌分離用培養(yǎng)基10 g，瓊脂10 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.8；③雙層培養(yǎng)基上層。通威光合菌分離用培養(yǎng)基10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值7.4～7.8[7]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離。①酵母菌、霉菌、芽孢桿菌的分離。稱取適量豬糞，制成菌懸液，分別加入酵母菌、霉菌、芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min下富集培養(yǎng)。將富集后的菌液采用稀釋涂布法分離，劃線純化，最后挑取單菌落至斜面保存?zhèn)溆?。②乳酸菌的分離。稱取適量豬糞，制成菌懸液，加入乳酸菌的液體分離培養(yǎng)基，30 ℃下靜置富集培養(yǎng)。將富集后的菌液稀釋涂布法分離，劃線純化，采用厭氧盒厭氧培養(yǎng)，最后挑取單菌落至斜面保存?zhèn)溆谩＂酃夂暇姆蛛x。取10 g魚(yú)塘的污泥加入250 mL無(wú)菌錐形瓶中，注滿培養(yǎng)基，密封瓶口，置于30 ℃、白熾燈光照下厭氧富集培養(yǎng)。待液體培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色或紅褐色時(shí)轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基，2～3次重復(fù)。將富集后的菌液梯度稀釋，取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 3個(gè)稀釋度的菌液與冷卻至40～50 ℃的雙層培養(yǎng)基下層相混合注入平皿，待下層培養(yǎng)基凝固后注入上層培養(yǎng)基[7]。采用雙層平板法多次分離得到純菌落后，接種于含液體培養(yǎng)基的厭氧瓶中培養(yǎng)，保種備用。

1.2.2 菌株的篩選。將篩選出的菌株液體培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，取菌液稀釋10倍后按照10%接種量接入新鮮豬糞中，每天用感官法初步判定微生物的除臭效果，重復(fù)幾次，篩選出具有除臭作用的微生物。

1.2.3 菌株的鑒定。試劑盒提取菌株的基因組DNA（酵母菌為26S D1/D2區(qū)，真菌為18S rDNA，細(xì)菌為16S rDNA），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測(cè)序[8]。

1.2.4 功能菌組合比例優(yōu)化。選擇Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1 6株菌做正交試驗(yàn)，采用L27（313）正交表，以Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1作為A、B、C、D、E、F 6個(gè)考察因素，選取3個(gè)添加量水平進(jìn)行配制菌劑，取5 mL稀釋10倍后的混合菌劑用于除臭試驗(yàn)，以5 d后裝置內(nèi)的綜合惡臭濃度為指標(biāo)考察效果（表1）。

1.2.5 菌劑除臭試驗(yàn)。模擬圈舍面源污染，將100 g新鮮豬糞置于5 L的除臭裝置中（圖1），豬糞的厚度約為0.5 cm，加入5 mL稀釋10倍后的混合菌劑并攪拌均勻，將裝置密封，以200 mL/min的速度向裝置內(nèi)通空氣使裝置內(nèi)保持好氧環(huán)境，裝置后面連接2個(gè)吸收瓶。一級(jí)吸收瓶中裝有0.01 mol/L HCl溶液50 mL，用以吸收除臭裝置中產(chǎn)生的NH3和H2S，二級(jí)吸收瓶中裝有50 mL乙酸鋅-乙酸鈉溶液，用以吸收除臭裝置中產(chǎn)生的H2S。將除臭裝置置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天測(cè)定裝置內(nèi)的綜合惡臭、TVOC濃度和吸收瓶中的NH3和H2S含量。

1.2.6 綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的測(cè)定。綜合惡臭的測(cè)定：參照《空氣質(zhì)量惡臭的測(cè)定三點(diǎn)比較式臭袋法》（GB/T 14675—93）[9]；TVOC的測(cè)定：SLC-OP020手提式惡臭檢測(cè)儀，韓國(guó)科學(xué)技術(shù)分析中心[10]；NH3的測(cè)定：參照《水質(zhì)氨氮的測(cè)定納氏試劑分光光度法》（HJ 535—2009）[11]；H2S的測(cè)定：參照《水質(zhì)硫化物的測(cè)定亞甲基藍(lán)分光光度法》（GB/T 1 6489—1996）[12]。

1.2.7 去除率的計(jì)算。計(jì)算公式具體如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 除臭菌株的分離鑒定

從畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)、堆肥場(chǎng)、魚(yú)塘等場(chǎng)所共分離篩選到6株具有顯著除臭作用的微生物，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，Y-1為羅倫隱球酵母菌（Cryptococcus laurentii）；經(jīng)16S rDNA序列分析，B-1和B-2分別為Bacillus safensis和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），L-1為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），P-1為沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）；經(jīng)18S rDNA序列分析，M-1為卷枝毛霉（Mucor circinelloides）。

2.2 功能菌組配比例優(yōu)化

按照表1的正交因素水平設(shè)計(jì)L27（313）正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

由表2的極差分析結(jié)果可以看出，RE>RD>RA>RC>RF>RB，6株菌對(duì)綜合惡臭去除的影響大小依次為B-2（E）>B-1（D）>Y-1（A）>L-1（C）>P-1（F）>M-1（B）。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到除臭菌劑的最佳配方為E3D1A1C1F3B1，與直接觀察法得到的結(jié)果相同。因此，Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1的添加比例為1∶1∶1∶1∶3∶3時(shí)菌劑的除臭效果最好。

2.3 綜合惡臭的去除效果

如圖2所示，由于豬糞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，對(duì)照組和試驗(yàn)組的綜合惡臭濃度均隨時(shí)間的增加而逐漸降低。綜合惡臭的平均去除率為54.97%，去除率在第3天達(dá)到最大，為72.95%。

2.4 TVOC的去除效果

如圖3所示，由于TVOC的成分比較復(fù)雜，因此TVOC隨時(shí)間的變化沒(méi)有明顯規(guī)律。TVOC的平均去除率為18.66%，去除率在第3天達(dá)到最大，為35.26%。

2.5 NH3的去除效果

如圖4所示，試驗(yàn)初期1～4 d，有機(jī)物質(zhì)在微生物的作用下快速分解，氨氣的釋放量迅速升高，在第4天氨氣的釋放達(dá)到最高峰，然后氨氣釋放量迅速下降并趨于平穩(wěn)。試驗(yàn)組的NH3釋放量低于對(duì)照組，其主要原因是加入的除臭微生物控制了銨鹽的分解，以及銨態(tài)氮被除臭微生物轉(zhuǎn)化為其他形式的氮而被固定下來(lái)。NH3的平均去除率為13.12%，去除率在第5天達(dá)到最大，為20.20%。

2.6 H2S的去除效果

如圖5所示，試驗(yàn)初期有機(jī)物質(zhì)在微生物的作用下快速分解，H2S的釋放量迅速升高，對(duì)照組的H2S釋放量在第4天達(dá)到最高峰，試驗(yàn)組的H2S釋放量在第5天達(dá)到最高峰，隨著有機(jī)物質(zhì)的消耗殆盡，H2S釋放量迅速下降。菌劑對(duì)H2S有明顯的去除效果，H2S的平均去除率為41.18%，去除率在第4天達(dá)到最大，為 81.28%。

2.7 復(fù)合菌劑除臭機(jī)理探討

相關(guān)文獻(xiàn)表明，復(fù)合菌劑原位除臭是一種基于微生物協(xié)同作用的多種菌群參與的除臭過(guò)程。酵母菌不僅可以分泌生理活性物質(zhì)，還可以給其他有益微生物如乳酸菌等增殖所需要的基質(zhì)提供重要的給養(yǎng)保障，促進(jìn)有益微生物的快速生長(zhǎng)，使其成為優(yōu)勢(shì)菌種，從而抑制產(chǎn)臭微生物的生長(zhǎng)，減少惡臭氣體的釋放；而且酵母菌本身還可以產(chǎn)生一定量的香味，可以對(duì)糞便產(chǎn)生的惡臭氣體起到掩蓋作用[13]。霉菌能夠?qū)⒇i糞中不易降解的淀粉分解為小分子物質(zhì)，從而為其他除臭菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。乳酸菌能夠攝取光合菌、酵母菌產(chǎn)生的糖類形成乳酸，乳酸具有很強(qiáng)的殺菌能力，能夠抑制豬糞中產(chǎn)臭微生物的活動(dòng)和有機(jī)物的急劇腐敗分解；而且乳酸菌能夠分解豬糞中在常態(tài)下不易分解的木質(zhì)素和纖維素，并使有機(jī)物發(fā)酵分解。芽孢桿菌不僅具有分解作用，而且也能抑制NH3的產(chǎn)生。朱珊珊通過(guò)將枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵床生物除臭發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能夠抑制豬糞中NH3的產(chǎn)生[14]。光合菌能夠以豬糞中的有機(jī)物及有害氣體如H2S、NH3等為基質(zhì)，合成糖類、氨基酸類、維生素類、氮素化合物和生理活性物質(zhì)等，光合菌的代謝物質(zhì)可以成為其他微生物繁殖的養(yǎng)分，光合菌如果增殖，其他的有益微生物也會(huì)增殖。王艷朋通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，沼澤紅假單胞菌在厭氧條件下能夠降解芳香烴累物質(zhì)和3-氯苯酚等TVOC，而且光合菌在光照條件下能夠利用硫化氫等還原劑，經(jīng)細(xì)菌型光合作用將二氧化碳還原成為有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物[15]。Sawada通過(guò)試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)光合菌能夠?qū)⒘蚧镛D(zhuǎn)化為單質(zhì)硫[16]。本研究研制的復(fù)合菌劑中有酵母菌、芽孢桿菌、霉菌、乳酸菌及光合菌，屬于當(dāng)前生物除臭復(fù)合菌劑中的主流菌群，與EM菌中的功能菌類似，據(jù)此推測(cè)，復(fù)合菌中各種菌能發(fā)揮其功能并具有一定的協(xié)同作用，進(jìn)而取得良好的除臭效果。

3 結(jié)論與討論

（1）本研究中分離到6株具有除臭作用的微生物，為酵母菌1株、霉菌1株、乳酸菌1株、芽孢桿菌2株、光合菌1株。

（2）通過(guò)正交試驗(yàn)確定除臭菌劑中Y-1、M-1、L-1、B-1、B-2、P-1的最適比例為1∶1∶1∶1∶3∶3。

（3）將菌劑應(yīng)用于糞便除臭試驗(yàn)，菌劑對(duì)綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的平均去除率分別為54.97%、18.66%、13.12%、41.18%，對(duì)綜合惡臭、TVOC、NH3和H2S的最大去除率分別為72.95%、35.26%、20.20%、81.28%。

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