付岳 高旭年 黃杰

體外診斷試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源

付岳1高旭年2黃杰3★

體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是實(shí)現(xiàn)量值溯源、保證檢測(cè)數(shù)據(jù)和結(jié)果準(zhǔn)確一致的重要材料。自上世紀(jì)80年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室在體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制方面做了大量的工作。本文簡(jiǎn)要介紹了目前國(guó)內(nèi)研制的體外診斷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其研制中所采用的主要形式：以參考方法、參考系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為基礎(chǔ)的計(jì)量學(xué)溯源體系；以多中心合作標(biāo)定、一致化或類(lèi)似一致化的溯源體系，并針對(duì)兩種溯源體系的差別進(jìn)行了闡述。

體外診斷試劑； 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)； 量值溯源

近年來(lái)，我國(guó)體外診斷試劑（in vitro diagnos?tics，IVD）市場(chǎng)規(guī)模增長(zhǎng)迅速。針對(duì)紛雜的產(chǎn)品市場(chǎng)，為保證疾病的有效預(yù)防、診斷和治療監(jiān)測(cè)，相應(yīng)IVD產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)和監(jiān)管也日趨重要。而體外診斷試劑檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、不同廠家同類(lèi)產(chǎn)品檢驗(yàn)結(jié)果的一致性是IVD產(chǎn)品質(zhì)量的重要議題。IVD產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)一般還需要考慮與產(chǎn)品性能密切相關(guān)的準(zhǔn)確度、特異性、重復(fù)性、檢測(cè)限等指標(biāo)。

實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和可比性的重要手段是保證檢驗(yàn)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化和一致化，標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)是建立參考系統(tǒng)，包括參考方法、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和參考實(shí)驗(yàn)室等；一致化的基礎(chǔ)是在充分評(píng)估技術(shù)的原理、影響因素，分析不同技術(shù)檢測(cè)同一靶標(biāo)的差異，達(dá)成檢測(cè)結(jié)果可比的共識(shí)。標(biāo)準(zhǔn)化和一致化主要差別體現(xiàn)在量值溯源的方式。標(biāo)準(zhǔn)化的量值溯源方式是追求量值溯源至國(guó)際單位、參考方法、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等，一致化的溯源方式則是溯源至經(jīng)過(guò)認(rèn)可的方法、參考物質(zhì)。在完整的溯源、量值傳遞和校正過(guò)程中，體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果準(zhǔn)確一致的主要工具，也是保證量值有效傳遞的計(jì)量實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)［1］。同樣，在檢測(cè)結(jié)果一致化過(guò)程中，經(jīng)過(guò)認(rèn)可的方法和/或參考物質(zhì)也發(fā)揮了重要的傳導(dǎo)作用。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立IVD產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化和一致化，可實(shí)現(xiàn)臨床檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可比和可溯源。

目前國(guó)際上研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的組織主要有英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所（National Institute for Biologi?cal Standards and Control，NIBSC），美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST），位于比利時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和計(jì)量研究所（Institute of Reference Materials and Me?trology，IRMM）等。這些組織研制了大量的涉及無(wú)機(jī)成分、有機(jī)小分子、蛋白、抗體、激素、核酸等作為溯源的國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［2］。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作起步稍晚，自上世紀(jì)80年代也開(kāi)始研制臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，前期研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以無(wú)機(jī)成分、微量元素為主，后期開(kāi)始研制有機(jī)分子的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，2005年前后開(kāi)始研制核酸、蛋白等生物大分子的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［3］。已有多家參考實(shí)驗(yàn)室通過(guò)了中國(guó)實(shí)驗(yàn)室合格評(píng)定委員會(huì)的認(rèn)可，建立的參考方法涵蓋了酶學(xué)、小分子化合物、血脂、代謝物、離子以及甾體類(lèi)激素等［4］。并且為保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值溯源體系的建設(shè)及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室正在積極申請(qǐng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者能力認(rèn)可。目前基本相應(yīng)的建立了包含生物化學(xué)檢測(cè)，免疫學(xué)檢測(cè)，核酸檢測(cè)，血液體液檢測(cè)等幾大類(lèi)參考物質(zhì)，這些參考物質(zhì)為我國(guó)體外診斷試劑的量值溯源和檢測(cè)結(jié)果一致化做出了重要貢獻(xiàn)。但是針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制和溯源體系在不同的機(jī)構(gòu)有部分理解的不一致和差別，主要體現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的實(shí)際用途和組成形式上。有些機(jī)構(gòu)認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的主要用途是為測(cè)量程序或校準(zhǔn)品賦值，也有機(jī)構(gòu)認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的作用還應(yīng)該包含對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)，不同的用途造成了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組成形式的差別，也對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源體系造成了不一樣的理解。本文擬就目前我國(guó)體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其研制中所采用的主要形式進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹，并針對(duì)兩種溯源體系的差別進(jìn)行了闡述。

1 以參考方法或決定性方法和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為主要溯源體系的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

在計(jì)量學(xué)溯源途徑中，生物化學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般都是應(yīng)用已建立的參考方法進(jìn)行定值，并附有給定置信水平的不確定度，多用于臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目中的量值傳遞、準(zhǔn)確度質(zhì)量控制等。該類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要為定義明確的小分子化合物和蛋白質(zhì)分子，前者主要包括代謝產(chǎn)物/底物類(lèi)、離子類(lèi)、非肽激素類(lèi)、維生素與微量營(yíng)養(yǎng)素等，后者包括酶和其他蛋白。

1.1 小分子化合物類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

有機(jī)小分子臨檢項(xiàng)目的參考方法一般基于儀器分析原理，主要有同位素稀釋質(zhì)譜法（isotope dilution mass spectrometry，IDMS）、分光光度法及拉曼光譜法等。其中，同位素稀釋質(zhì)譜法是國(guó)際物質(zhì)的量咨詢(xún)委員會(huì)認(rèn)定的基準(zhǔn)測(cè)量方法，是目前國(guó)際公認(rèn)的可準(zhǔn)確測(cè)定小分子化合物的最可靠的分析原理之一。臨床化學(xué)領(lǐng)域中，同位素稀釋質(zhì)譜法與色譜結(jié)合使用在建立代謝產(chǎn)物/底物類(lèi)檢測(cè)的參考方法中應(yīng)用較廣，國(guó)內(nèi)現(xiàn)已建立針對(duì)肌酐、尿素、尿酸、葡萄糖、同型半胱氨酸、25?羥基維生素D、葉酸、游離甘油、甘油三酯、膽固醇的同位素稀釋質(zhì)譜參考方法，并且相應(yīng)的已研制完成多項(xiàng)國(guó)家一級(jí)、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［5，6］。考慮到互通性，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般采用公認(rèn)無(wú)基質(zhì)效應(yīng)的新鮮冰凍人血清。例如血清總膽固醇、總甘油等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，首先要采集健康志愿者的血清，再將血清按照性別及膽固醇水平制備不同濃度的混合血清池，經(jīng)過(guò)濾后分裝完成樣品制備；按照《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》（GB/T 15000.3?2008/ISO Guide35：2006）和國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范（JJG 1006?1994）的要求進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)；對(duì)于候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值則采用已建立的同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和高效液相色譜法等參考方法，測(cè)定結(jié)果均可溯源至國(guó)際單位；最后再評(píng)價(jià)該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互通性及適用性［7］。通過(guò)此類(lèi)方法制備的還包括冰凍人血清尿酸、肌酐成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，冰凍人血清中葡萄糖和冰凍人血清中尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等。非肽類(lèi)激素和離子類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的參考測(cè)量方法主要也是同位素稀釋質(zhì)譜法，其制備原料的選擇和制備過(guò)程也與代謝物/底物類(lèi)相似，目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括雌二醇、17α?羥孕酮、孕酮和人血清鉀、鎂、鈣等［8］。此外，在測(cè)定血清鈣等離子類(lèi)項(xiàng)目時(shí)，通常需要用多接收電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP?MS）先測(cè)定濃縮同位素的豐度比值，并計(jì)算濃縮同位素的濃度，不過(guò)國(guó)內(nèi)已有實(shí)驗(yàn)室在英國(guó)政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室同位素稀釋法原理基礎(chǔ)上建立了反應(yīng)池?兩步同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定血清總鈣的參考方法，大幅降低了實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器性能的要求［9］。

1.2 酶學(xué)、血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

酶催化濃度測(cè)量是臨床檢驗(yàn)的特殊情況，由于是活性測(cè)量，其測(cè)定結(jié)果依賴(lài)于測(cè)量過(guò)程。目前國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟（International Federation of Clinical Chemistry and laboratory med?icine，IFCC）共頒布8個(gè)技術(shù)文件，分別講述37℃下測(cè)定肌酸激酶（creatine kinase，CK）等7種酶的催化濃度的參考方法。目前我國(guó)已有多家實(shí)驗(yàn)室建立了酶學(xué)參考方法并通過(guò)了酶學(xué)參考實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)證。酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也采用了人源血清標(biāo)本，相應(yīng)的人血清中乳酸脫氫酶活性濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，冰凍人血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等復(fù)合酶類(lèi)催化活性濃度一級(jí)、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也已制備完畢［10，11］。同時(shí)，國(guó)內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室也參加了由IFCC組織的參考實(shí)驗(yàn)室室間比對(duì)，各種酶室間變異及小組均值與國(guó)外實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)相比沒(méi)有明顯差別［12］。

在血液體液檢測(cè)領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室在國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)委員的指導(dǎo)下，也相應(yīng)建立了血細(xì)胞分析的參考方法，并與國(guó)外參考實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期進(jìn)行高頻率的結(jié)果比對(duì)。國(guó)內(nèi)首家通過(guò)ISO 17025?2005和ISO 15195?2003認(rèn)可的血細(xì)胞分析參考測(cè)量實(shí)驗(yàn)室也成功獲批。此外，為解決血細(xì)胞分析檢測(cè)結(jié)果的溯源問(wèn)題，國(guó)內(nèi)也以國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（international council for standard?ization in haematology，ICSH）發(fā)布的參考方法為溯源標(biāo)準(zhǔn)研制出血細(xì)胞分析國(guó)家一級(jí)、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白測(cè)定和血小板計(jì)數(shù)，氰化高鐵血紅蛋白國(guó)家一級(jí)、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等［13?14］。這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制和應(yīng)用，對(duì)于推動(dòng)我國(guó)血細(xì)胞分析標(biāo)準(zhǔn)化工作的發(fā)展具有重要意義。

由此可知，對(duì)于膽固醇、肌酐、葡萄糖、激素等被測(cè)量定義明確的小分子化合物，參考方法和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的建立具有成熟的基礎(chǔ)。但對(duì)于大多數(shù)蛋白分子建立參考方法仍然任重道遠(yuǎn)。建立的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在IVD產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)中可以用于準(zhǔn)確度、線性、檢測(cè)限等項(xiàng)目的樣本（或樣本之一），對(duì)于特異性等指標(biāo)的評(píng)價(jià)則需要采用其他的樣本進(jìn)行。

2 采用多中心合作標(biāo)定、一致化或類(lèi)似一致化溯源體系的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

多中心合作標(biāo)定是通過(guò)多中心采用規(guī)定的方法或不同原理的方法進(jìn)行特性值的賦值，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方式對(duì)多中心的賦值進(jìn)行處理后給出靶值的方式，一致化簡(jiǎn)單的來(lái)說(shuō)就是通過(guò)認(rèn)可的方法，該方法并不是參考方法，依靠或不依靠參考物質(zhì)對(duì)候選參考物質(zhì)的特性量值進(jìn)行賦值。在目前的臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目中，存在參考方法的僅為少數(shù)，因此大多數(shù)檢驗(yàn)項(xiàng)目、國(guó)內(nèi)的大多數(shù)免疫和核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都采用了一致化或類(lèi)似一致化的溯源體系進(jìn)行溯源。

2.1 免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

在蛋白質(zhì)大分子的檢測(cè)中主要使用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，包含化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法、時(shí)間分辨免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫比濁法等。由于沒(méi)有絕對(duì)權(quán)威的參考方法，目前世界衛(wèi)生組織以及國(guó)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室采用多中心合作研究的方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值。激素及腎上腺皮質(zhì)激素等甾體激素的常規(guī)檢驗(yàn)方法一般有免疫熒光分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析等，國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)也列舉了部分非肽類(lèi)激素的參考測(cè)量方法，但大部分激素現(xiàn)階段無(wú)法通過(guò)參考方法的形式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。例如人絨毛膜促性腺激素（human cho?rionic gonadotropin，HCG）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因?yàn)樵谌焉锖妥甜B(yǎng)葉細(xì)胞疾病的婦女血清中，發(fā)現(xiàn)有多種具有免疫活性的HCG分子形式，他們包括完整HCG、脫β?羧基末端的HCG、β?HCG核心片段、缺刻HCG（Nicked HCG）、HCG糖變異體、游離β?HCG和游離α?HCG，對(duì)于參考方法溯源體系來(lái)說(shuō)HCG分子則是定義不明確的分子。所以HCG標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)就是采用多中心合作標(biāo)定或者說(shuō)類(lèi)似一致化的溯源體系進(jìn)行溯源。在建立HCG國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)程中，首先精確量取來(lái)源于妊娠婦女尿液的高純HCG原料、人血白蛋白和海藻糖，加入至磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH=7.4）內(nèi)，無(wú)菌過(guò)濾后分裝，再凍干制備成HCG國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品候選品。以HCG第五次國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（07/364）為對(duì)照品，采用9個(gè)廠家10種HCG檢測(cè)試劑盒（包括化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、磁微粒分離酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫法、時(shí)間分辨免疫熒光分析法等）進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，同時(shí)對(duì)候選品的瓶間精密度、穩(wěn)定性進(jìn)行分析。制備的候選品與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品同質(zhì)，滿(mǎn)足用于HCG免疫分析及相應(yīng)試劑盒的性能評(píng)價(jià)［15］。此外，類(lèi)似于HCG，中國(guó)食品藥品檢定研究院還研制了胰島素、三碘甲腺原氨酸、四碘甲腺原氨酸（即甲狀腺素）、人胰島素C?肽、促甲狀腺激素、反三碘甲狀腺原氨酸、促黃體生成素、促卵泡生成素、泌乳素、生長(zhǎng)激素、人胎盤(pán)泌乳素等。

對(duì)于腫瘤標(biāo)志物類(lèi)以及感染性疾病抗原抗體的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)也主要采用純品或血清樣本聯(lián)合定值，并且大多溯源到NIBSC研制的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。例如甲胎蛋白等就是使用高純?cè)贤ㄟ^(guò)酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法等不同方法進(jìn)行聯(lián)合定值，溯源到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，其目的主要為試劑盒注冊(cè)檢驗(yàn)及市場(chǎng)流通監(jiān)管，也有助于生產(chǎn)企業(yè)對(duì)其產(chǎn)品進(jìn)行量值溯源［16］。乙型肝炎表面抗原、梅毒螺旋體抗體等是采用血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)進(jìn)行定值［17］。根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也可以有不同組成，傳染病體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般由陽(yáng)性參考品、陰性參考品、最低檢出量參考品、精密性參考品及定量參考品等組成［18］。國(guó)內(nèi)目前已經(jīng)研制的風(fēng)疹病毒IgM抗體，丙型肝炎抗體，巨細(xì)胞病毒IgG、IgM抗體等多種標(biāo)準(zhǔn)品和參考盤(pán)等，大多是通過(guò)試劑盒篩選出陽(yáng)性和陰性血清，再根據(jù)預(yù)設(shè)的性能指標(biāo)制備參考盤(pán)，用于全面控制診斷試劑的質(zhì)量，主要控制試劑的特異性、靈敏度、精密度及定量試劑的準(zhǔn)確性等［19?20］。

需要注意的是，由于在三碘甲腺原氨酸、四碘甲腺原氨酸（即甲狀腺素）、人胰島素C?肽、反三碘甲狀腺原氨酸等激素方面也發(fā)展了參考方法，對(duì)于此類(lèi)同時(shí)存在兩種溯源體系的情況，不同溯源體系的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)之間的相關(guān)性以及對(duì)檢測(cè)試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的影響也需要進(jìn)行充分評(píng)估。

2.2 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，核酸檢測(cè)在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但核酸檢測(cè)易受到不同檢測(cè)原理、樣本基質(zhì)、檢測(cè)病毒基因變異、人群中基因多態(tài)性以及不同基因突變類(lèi)型等多種因素的影響，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果，在準(zhǔn)確性、量值、靈敏度和特異性方面也出現(xiàn)較大的差異。為使不同實(shí)驗(yàn)室，不同方法間檢測(cè)的結(jié)果具有可比性，就必須使檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化。但由于缺乏一級(jí)參考測(cè)量程序，所以大部分核酸類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也都是經(jīng)過(guò)多中心合作聯(lián)合定值，其制備過(guò)程已經(jīng)程序化。在定值方法上，主要有紫外分光光度法、熒光染料法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、磷元素同位素定量方法、脫氧單磷酸核苷定量的同位素稀釋質(zhì)譜法、數(shù)字PCR方法等。其中數(shù)字PCR方法是比較新的一種DNA定量技術(shù)，此方法不需要線性標(biāo)準(zhǔn)品即可計(jì)算出待檢DNA分子的拷貝數(shù)，目前NIST等國(guó)際機(jī)構(gòu)已有核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用數(shù)字PCR方法進(jìn)行定值。但是現(xiàn)有的技術(shù)還很難從絕對(duì)意義上對(duì)核酸的量值進(jìn)行確定。

一般WHO為病毒核酸擴(kuò)增技術(shù)制定的國(guó)際參考物質(zhì)來(lái)源于稀釋后凍干分裝的且含滅活野生型病毒的人混合陽(yáng)性血漿，表述單位通常為IU（international unit）。這種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值為WHO經(jīng)多中心研究確定其可以作為第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考制劑后，通過(guò)主觀方式賦予的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值，后來(lái)的替代標(biāo)準(zhǔn)則以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值為標(biāo)準(zhǔn)繼續(xù)通過(guò)國(guó)際多中心合作來(lái)定值。規(guī)定IU可以使某種物質(zhì)的生物活性在國(guó)際上使用同一種計(jì)量單位表示，而使不同于國(guó)際單位的單位體系具有互通性。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)在核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制方面也做了大量的工作，早期研制的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、丙型肝炎病毒核糖核酸血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)被國(guó)家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)為國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其量值可溯源到第一代國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品［21］。人脲原體核酸檢測(cè)國(guó)家參考品，人乳頭瘤病毒全基因組基因分型國(guó)家參考品等的建立也對(duì)相應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行了規(guī)范［22?23］。此外，國(guó)內(nèi)已發(fā)布的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還包括乙型肝炎分型、丙型肝炎分型、人免疫缺陷病毒?1、人免疫缺陷病毒?1分型、人免疫缺陷病毒?2、沙眼衣原體、禽流感H7N9、結(jié)核分枝桿菌，EB病毒等。以上介紹的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大部分是用接近天然基體的生物材料制備而成。目前國(guó)內(nèi)也有實(shí)驗(yàn)室采用人工合成的方法，基于MS2噬菌體衣殼蛋白包裝外源RNA的病毒樣顆粒，研制無(wú)生物傳染危險(xiǎn)性且穩(wěn)定的RNA病毒核酸質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［24］。

同時(shí)，隨著測(cè)序技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，為建立能對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)及相關(guān)試劑產(chǎn)品進(jìn)行有效性能評(píng)估，中國(guó)食品藥品檢定研究院采用多中心合作標(biāo)定的方式研制了測(cè)序儀性能評(píng)價(jià)用DNA參考品和高通量測(cè)序檢測(cè)外周血胎兒染色體非整倍體參考品。針對(duì)高通量測(cè)序檢測(cè)外周血胎兒染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒的影響因素，如母親外周血中胎兒游離DNA的含量、胎兒三體的不同類(lèi)型（如標(biāo)準(zhǔn)三體、嵌合體以及平衡易位突變等）對(duì)結(jié)果的影響、DNA序列差異對(duì)結(jié)果的影響特別是高GC含量序列對(duì)結(jié)果的影響、小片段DNA分子在分離純化中的片段篩選、文庫(kù)構(gòu)建中的偏移、測(cè)序文庫(kù)的庫(kù)容和量、在軟件分析中采用的算法主要基于的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理、在結(jié)果分析中原始數(shù)據(jù)是否符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求、參考數(shù)據(jù)庫(kù)的建立等，高通量測(cè)序檢測(cè)外周血胎兒染色體非整倍體參考品中針對(duì)性的設(shè)計(jì)了數(shù)據(jù)量控制參考品、陽(yáng)性參考品、微缺失微重復(fù)參考品、嵌合體參考品、檢測(cè)限參考品、陰性參考品等參考品組成了參考盤(pán)，可以合理地進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3 展望

綜上所述，自上世紀(jì)80年代以來(lái)，從無(wú)機(jī)元素、有機(jī)小分子逐漸發(fā)展到核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，從純物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)逐漸發(fā)展到基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，國(guó)內(nèi)體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)大幕的拉開(kāi)，相關(guān)的診斷技術(shù)將迎來(lái)快速發(fā)展的春天。為了保證臨床診斷的檢測(cè)質(zhì)量，需要及時(shí)建立新的可靠的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，這也就對(duì)我國(guó)體外診斷試劑量值溯源工作提出了更高的要求。相信在不久的將來(lái)，經(jīng)認(rèn)可的適用于臨床檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)將會(huì)越來(lái)越多，它們將對(duì)臨床檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化、一致化檢測(cè)起到積極作用，為臨床正確診斷和合理用藥提供重要依據(jù)。

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Quality evaluation of in vitro diagnostic reagents and traceability of reference materials

FU Yue1，GAO Xunian2，HUANG Jie3★
(1.Beijing Institute of Medical Device Testing,Beijing,China,101111;2.Guangzhou Bangdesheng Biological Technology Co.,Ltd,Guangdong,Guangzhou,China,510665;3.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing,China,100050)

Reference materials for in vitro diagnostic reagents are important in achieving the traceability of measurements and guaranteeing the quality of the test data as well as the result.Since the 1980s, domestic laboratories have done much work in the preparation of reference materials for in vitro diagnostic reagents.This article aims to introduce the reference materials of in vitro diagnostic reagents and its traceability systems:the metrological traceability system,which is based on reference procedures,reference materials,and reference systems;and the homogenization traceability system based on collaborative study to determine the assignment of value to reference materials.

In vitro diagnostic reagents;Reference materials;Traceability of measurements

1.北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，北京101111 2.廣州邦德盛生物科技有限公司，廣東，廣州510665 3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050

★通訊作者：黃杰，E?mail：jhuang5522@126.com