彭慶濤

(遼寧省本溪縣林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展局，遼寧 本溪 117100)

基因工程在林木抗寒中的應(yīng)用研究進(jìn)展

彭慶濤

(遼寧省本溪縣林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展局，遼寧 本溪 117100)

文章綜述了基因工程在林木抗寒方面的研究進(jìn)展，包括結(jié)構(gòu)基因、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。

基因工程；林木；抗寒

逆境會(huì)傷害植物，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡。當(dāng)溫度下降到0℃以下時(shí)，植物體內(nèi)發(fā)生冰凍，因而受傷甚至死亡，這種現(xiàn)象稱為凍害。樹(shù)木在生長(zhǎng)期中如遇到溫度的突然變化，會(huì)打亂植物生理進(jìn)程的程序而造成傷害，迄今為止，尚沒(méi)有解決低溫凍害的根本辦法。隨著基因工程的發(fā)展，在樹(shù)木的抗寒性研究方面取得了進(jìn)展。本文就結(jié)構(gòu)基因、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)基因技術(shù)在林木抗寒中的應(yīng)用與研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述，以期為林木抗寒相關(guān)研究提供參考。

1 結(jié)構(gòu)基因

結(jié)構(gòu)基因是一類(lèi)編碼蛋白質(zhì)的基因，大多數(shù)真核生物的基因是不連續(xù)基因。所謂不連續(xù)基因就是指基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，被非編碼序列所隔開(kāi)。編碼的序列稱為外顯子，是一個(gè)基因表達(dá)為多肽鏈的部分；非編碼序列稱為內(nèi)含子，又稱插入序列。內(nèi)含子只轉(zhuǎn)錄，在前mRNA時(shí)被剪切掉。一些抗寒相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因，通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成RNA，再通過(guò)翻譯形成相關(guān)的蛋白質(zhì)，進(jìn)而表現(xiàn)出抗寒的特性。2003年，李春霞從胡蘿卜中克隆得到抗凍蛋白基因，并轉(zhuǎn)入山楊，得到轉(zhuǎn)基因植株后經(jīng)PCR檢測(cè)獲得1株卡那霉素的轉(zhuǎn)基因株系，結(jié)果表明目的基因AFP基因已被整合進(jìn)山楊基因組中[1]。2007年，Benedict等將擬南芥抗寒相關(guān)基因CBF1基因轉(zhuǎn)化到楊樹(shù)基因組中，并證明該基因的成功表達(dá)可提高楊樹(shù)的抗寒性。

2 順式作用元件

順式作用元件，位于結(jié)構(gòu)基因的旁側(cè)，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、應(yīng)答元件。它是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)這種結(jié)合進(jìn)而調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，確保轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄效率。目前此方面在林木中研究較少，相對(duì)滯后。此外，Li等[2]研究表明不同基因啟動(dòng)子對(duì)抗逆基因的表達(dá)作用不同，其中cor15基因啟動(dòng)子要弱于cor15b基因啟動(dòng)子對(duì)抗逆基因表達(dá)活性的影響，此外還發(fā)現(xiàn)這種影響不僅與順式作用元件種類(lèi)有關(guān)，也與其數(shù)量密切相關(guān)。Khurana 等[3]發(fā)現(xiàn)CCAAT-box和HSEs作為小分子熱激蛋白sHSP26啟動(dòng)子中重要的熱激元件在表達(dá)調(diào)控中起了決定性的作用。

3 轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子即能夠結(jié)合在基因上游的特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，并能調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控核糖核酸聚合酶(RNA聚合酶，或叫RNA合成酶)與DNA模板的結(jié)合。同時(shí)在與該基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的同時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子還可以與其他一些轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，進(jìn)一步影響基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成。2014年，羅夢(mèng)雪等[4]從麻瘋樹(shù)基因組中克隆到一個(gè)CBF2基因(命名為JcCBDF2)。運(yùn)用生物信息學(xué)的分析手段對(duì)該基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，JcCBDF2蛋白中不止包含AP2/EREBP保守的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，還具有CBF轉(zhuǎn)錄因子特征序列。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示基因主要在麻瘋樹(shù)葉片內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)低溫脅迫極其敏感，初步研究表明基因是低溫誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子。趙天田，王貴禧，梁麗松等[5]根據(jù)平榛花芽轉(zhuǎn)錄本高通量測(cè)序的結(jié)果，采用RACE-PCR技術(shù)克隆到平榛 S4OQ 基因，并對(duì)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析，表明: 平榛雌花芽中的表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量逐漸下降，在不同器官中的表達(dá)具有差異性，雄花序中表達(dá)量最高。楊杞，白肖飛，高陽(yáng)等[6]以沙冬青為試驗(yàn)材料，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析，運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其編碼的氨基酸序列具有CBF家族基因特有的AP2結(jié)構(gòu)域。為進(jìn)一步研究植物抗逆和獲得抗性基因提供了新的候選基因。

4 其他

4.1 小G蛋白基因

小G蛋白分子量約為20-30KD具有GTP酶活性，在多種細(xì)胞反應(yīng)中起開(kāi)關(guān)作用。當(dāng)小G蛋白與GTP結(jié)合時(shí)成為活化形式，作用于下游分子并將其活化。當(dāng)GTP水解成為GDP時(shí)，小G蛋白恢復(fù)為非活化狀態(tài)。黃亞成等[7]從橡膠樹(shù)膠乳cDNA文庫(kù)中克隆1個(gè)小G蛋白的基因全長(zhǎng)，進(jìn)行了聚類(lèi)和表達(dá)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量的方法研究該基因低溫處理下的表達(dá)水平。結(jié)果顯示4℃低溫脅迫下該基因在橡膠樹(shù)幼苗根中的表達(dá)明顯受誘導(dǎo)且在脅迫初期表達(dá)最強(qiáng)，后又有所下降，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

4.2 microRNA

microRNA(或miRNA)是指參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控，由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。目前，關(guān)于MicroRNA 的調(diào)控機(jī)理還不太清楚。2012年，張譯云[8]以毛白楊為材料，進(jìn)行不同時(shí)間段(0、8、14、20 h)的低溫脅迫 (4℃)處理，分別提取小片段 RNAs (<200 nt)，利用實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)研究毛白楊在低溫脅迫后 12 種miRNAs 的差異表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，miRNAs 的表達(dá)在低溫脅迫下有顯著變化，且呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)反應(yīng)。在低溫脅迫下，大部分miRNAs的表達(dá)受到抑制。miR168a、miR169ac、miR394a-3p、miR530a的表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間段顯著下調(diào)。表明，miRNAs在調(diào)控毛白楊對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)中起著重要作用。2012年，張譯云以毛白楊為試材，通過(guò)構(gòu)建microRNA的cDNA文庫(kù)，經(jīng)高通量測(cè)序獲得144個(gè)保守microRNA和29個(gè)新microRNA，并用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了新microRNA的101個(gè)靶基因，且這些靶基因均與植物生長(zhǎng)或逆境脅迫密切相關(guān)。該研究對(duì)進(jìn)一步探討microRNA在毛白楊經(jīng)低溫脅迫后的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

4.3 具體功能不清楚的基因

有些基因功能的研究還不是太清楚，只知道與植物抗寒相關(guān)。2014年，鄧治等[9]利用36個(gè)RAPD引物和7對(duì)ILP引物分別分析30份抗寒性差異的橡膠樹(shù)種質(zhì)DNA的多態(tài)性。通過(guò)RAPD引物擴(kuò)增，Blast比對(duì)和半定量RT-PCR分析表達(dá)模式表明低溫能調(diào)控HbR6PF基因的表達(dá)。2014年，彭亞蘭等[10]通過(guò)RACE方法克隆到桐花樹(shù)的一個(gè)延伸因子基因，多序列比對(duì)結(jié)果表明該氨基酸序列與琴葉擬南芥EF1A的氨基酸序列高度相似(97.7%)?；虮磉_(dá)分析結(jié)果顯示AcEF1A在莖尖中的表達(dá)量最高，葉片中的表達(dá)量次之，根中的表達(dá)量最低。低溫脅迫下，桐花樹(shù)葉片中AcEF1A 基因的表達(dá)水平有不同程度的上調(diào)。這些結(jié)果表明AcEF1A基因可能參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及逆境響應(yīng)過(guò)程。

5 林木抗寒展望

目前，抗寒性研究是林業(yè)抗逆性研究中重要一項(xiàng)，并已深化到基因水平。雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在一定的爭(zhēng)議而且植物抗寒性狀作為質(zhì)量性狀多受多基因控制，抗寒分子機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，目前對(duì)這方面的研究仍不夠透徹，經(jīng)基因轉(zhuǎn)化獲得的抗寒性植株還有很大的盲目性。但利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加林木抗寒性，并不涉及食品安全問(wèn)題，同時(shí)一些寒冷脅迫應(yīng)答基因已陸續(xù)被鑒定，很多關(guān)鍵基因已通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功提高了林木的抗寒性。近年來(lái)，在大數(shù)據(jù)時(shí)代的潮流中，基因芯片、轉(zhuǎn)錄組等高通量生物技術(shù)的成功應(yīng)用進(jìn)一步加快了抗寒相關(guān)候選基因的鑒定，因此運(yùn)用基因工程技術(shù)改善植物抗寒性將擁有越來(lái)越好的前景。

[1] 馮連榮,宋立志,林曉峰.楊樹(shù)抗寒育種研究進(jìn)展[J].防護(hù)林科技,2010(1)：92-94

[2] Li F, Han YY, Feng Y, et al. Expression of wheat expansin driven by the RD29 promoter in tobacco confers water-stress tolerance without impacting growth and development[J]. Biotechnol, 2013,163(3)：281-291

[3] Khurana N, Chauhan H, Khurana P. Wheat chloroplast targeted sHSP26 promoter confers heat and abiotic stress inducible expression in transgenic Arabidopsis plants[J]. PLOS One, 2013, 8(1)：e54418[4] 羅夢(mèng)雪,高繼海,時(shí)小東,等. 麻瘋樹(shù)耐冷基因JcCBF2的克隆及表達(dá)模式分析[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào),2014,51(6)

[5] 趙天田,王貴禧,梁麗松,等.平榛ChWRKY2轉(zhuǎn)錄因子的克隆及在低溫脅迫下的表達(dá)分析[J].林業(yè)科學(xué)研究,2012,25(2):144-149

[6] 楊杞,白肖飛,高陽(yáng),等.沙冬青CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子的cDNA克隆及序列分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2009,28(6):1043-1048

[7] 黃亞成,秦云霞,劉林婭,等.橡膠樹(shù)HbRAN1基因的克隆與表達(dá)[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2013,34(7):1257-1263

[8 ] 張譯云,任媛媛,陳磊,等.毛白楊12種microRNAs的低溫脅迫差異表達(dá)分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2012，28(7)：1-7

[9] 鄧治,李德軍.利用RAPD和ILP技術(shù)篩選橡膠樹(shù)抗寒分子標(biāo)記[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2014,33(1)：145-152

[10] 彭亞蘭,王友紹. 紅樹(shù)植物桐花樹(shù) EF1A 基因的克隆與表達(dá)分析[J].生態(tài)科學(xué),2014,33(4):704-712

1005-5215(2017)10-0087-02

2017-09-07

彭慶濤(1972-)，男，遼寧本溪人，大學(xué)，高級(jí)工程師，主要從事林業(yè)產(chǎn)業(yè)工作，E-mail：bxxcyb@163.com

S718.43

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2017.10.033