王立亞415000湖南省常德市武陵區(qū)疾病預防控制中心

湘南地區(qū)煤礦從業(yè)人員結(jié)核病流行菌株及耐藥情況分析

王立亞
415000湖南省常德市武陵區(qū)疾病預防控制中心

目的：調(diào)查湘南地區(qū)煤礦從業(yè)人員結(jié)核病患病及結(jié)核分枝桿菌流行和耐藥情況，為煤礦從業(yè)人員結(jié)核病的防治提供依據(jù)。方法：收集本地區(qū)確診的有煤礦從業(yè)史(≥1年)的結(jié)核病患者痰液標本，分離培養(yǎng)和抗結(jié)核藥物耐藥性檢測。結(jié)果：共收集痰標本436份，鏡檢陽性率為39.91%，培養(yǎng)陽性率25.92%，耐藥率25.66%。初治病例組鏡檢和培養(yǎng)陽性率均高于復治病例組，單耐藥及多耐藥率均低于復治病例組。結(jié)論：本地區(qū)煤礦從業(yè)人員結(jié)核病以北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染為主，且復治病例耐藥率明顯高于初治病例，應加強對煤礦從業(yè)人群的結(jié)核病防控。

結(jié)核分枝桿菌；耐藥性；煤礦從業(yè)人員；北京基因型

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的嚴重危害人類健康的慢性傳染性疾病，已經(jīng)成為當前不容忽視的公共衛(wèi)生問題。2010年中國新發(fā)現(xiàn)結(jié)核病例91萬例，占當年全球總發(fā)病人數(shù)的1/6[1]，并且由于未進行大規(guī)模的長期、規(guī)范、系統(tǒng)的治療，導致耐藥和耐多藥結(jié)核不斷出現(xiàn)。我國2007-2008年的結(jié)核病耐藥基線調(diào)查結(jié)果顯示，全國結(jié)核病耐多藥率8.32%，廣泛耐藥率0.68%[2]。煤礦從業(yè)人員是一類特殊的人群，由于其工作環(huán)境的特殊性，導致其成為結(jié)核分枝桿菌感染的易感人群。本研究擬通過調(diào)查本地區(qū)煤礦從業(yè)人員的結(jié)核病患病及耐藥情況分析，為煤礦從業(yè)人員這一特定人群的結(jié)核病防治提供依據(jù)。

資料與方法

選取在常德市和益陽市各級疾病預防控制中心登記在冊的有煤礦從業(yè)史(≥1年)的結(jié)核病患者進行回訪并采集痰液樣本，研究對象均為男性，年齡19～65歲，平均41.3歲。所有調(diào)查對象留取清晨由肺部深處咳出的痰進行萋-尼(Ziehl-Neelsen)染色，剩余部分加入4%氫氧化鈉，并接種于酸性羅氏培養(yǎng)基上。

主要試劑與儀器：4種一線抗結(jié)核藥物：異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)。分枝桿菌分離培養(yǎng)基及藥敏實驗培養(yǎng)基(7H9液體培養(yǎng)基)由本實驗室自行配制。Tap DNA聚合酶、dNTP、引物購自北京天根生物科技公司，TGRADINENT PCR儀、微量凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Bio-RAD公司。

分枝桿菌分離培養(yǎng)及藥敏實驗：臨床分離培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)種于含各種抗結(jié)核藥物的藥敏培養(yǎng)基上。藥物敏感試驗采用絕對濃度法。將酸性羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)出來的結(jié)核分枝桿菌加入0.5%吐溫-80生理鹽水中，與標準麥氏比濁管(MacFarland No.1)對比，得到1 mg/mL的菌液。靜置片刻后用刻度吸管將菌液上清逐步稀釋至10～2 mg/mL和10～4 mg/mL。用22 SWG標準接種環(huán)分別蘸取1滿環(huán)，劃線法均勻接種至對照及含藥培養(yǎng)基表面，接種置于37℃恒溫箱培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。

結(jié)核分枝桿菌總DNA提取：采用熱裂解法提取總DNA，從分離培養(yǎng)基上刮取適量菌體溶于蒸餾水，漩渦振蕩器上振蕩使菌落溶解均勻。于80℃滅活30 min，8 000 r/min離心。棄上清后加400 μL TE混懸后，煮沸30 min，離心后上清即為結(jié)核分枝桿菌DNA，分裝于EP管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分離菌株的鑒定：采用RD105缺失基因檢測法鑒定“北京家族”菌株，上游引物F：5'-CGTGCA CAGTTGCGTGTGTA-3'； 下 游 引 物 R： 5'-CGTCGTATTCTGCCGATACT-3′。PCR擴增片段長度266 bp。PCR反應體系：Tap DNA聚合酶0.5 μL，dNTP 2.0 μL(2.5 mmol/L)，引物各5 pmol，DNA 5.0 μL，10×PCRBuffer 2.5 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，70℃45 s，共30個循環(huán)；最后68℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR檢測陽性說明菌株存在RD105基因缺失則鑒定為“北京家族”菌株。

表3 初治與復治病例的耐藥情況分析[n(%)]

表4 北京基因型與非北京基因型的耐藥情況分析[n(%)]

結(jié)果

結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)及基因型鑒定：共收集436份痰標本，其中初治病例標本128份，復治病例標本308份，染色后鏡檢陽性標本174份，鏡檢陽性率39.91%(174/436)，分離得到113株結(jié)核分枝桿菌。培養(yǎng)陽性率25.92%(113/436)，RD105基因缺失法檢測出北京基因型菌株72株(PCR檢測陽性)，占63.72%(72/ 113)，見表1。

結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對一線抗結(jié)核藥物的耐藥情況：分離培養(yǎng)得到113株結(jié)核分枝桿菌，對一種抗結(jié)核藥物具有耐藥性29株，其中耐異煙肼(H)12株、耐利福平(R)8株、耐鏈霉素(S)5株、耐乙胺丁醇(E)4株，對單一抗結(jié)核藥物耐藥率分別為 H 10.62%、R 7.08%、S 4.42%、E 3.54%，總耐藥率25.66%。對兩種及以上耐藥8株，耐多藥率7.08%(8/ 113)，見表2。

表1 結(jié)核病患者痰標本鏡檢和培養(yǎng)陽性率及臨床分離菌株基因型分析[n(%)]

表2 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對一線抗結(jié)核藥耐藥情況

結(jié)核病初治與復治病例耐藥情況分析：本研究共培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌178株，其中初治病例單耐藥率和多重耐藥率分別為14.49%(10/69)和1.45%(1/69)，復治病例單耐藥率和多重耐藥率分別為43.18%(19/44)和15.91%(7/44)，初治病例和復治病例在單耐藥和多重耐藥率之間比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

結(jié)核分枝桿菌北京基因型與非北京基因型耐藥情況分析：本研究培養(yǎng)出的113株結(jié)核分枝桿菌中，北京基因型菌株單耐藥率和多重耐藥率分別為33.33% (24/72)和9.72%(7/72)，非北京基因菌株單耐藥和多重耐藥率分別為12.2%(5/41) 和2.44%(1/41)，兩者之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4。

討論

結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)寄生的致病菌，由于其細胞壁包有豐富的脂質(zhì)，并含有多種編碼調(diào)控突變性、潛伏性、持留性及致病性等特征的基因[3]，故長期潛伏于宿主體內(nèi)，對宿主造成長期、慢性損傷[4，5]。目前臨床上對結(jié)核病的診斷主要依靠臨床癥狀和影像學，結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)由于周期長、陽性率低，不能滿足臨床需求并容易導致患者漏診而延誤治療。本研究中在確診的結(jié)核病例中痰培養(yǎng)陽性率25.92%，且復治病例痰培養(yǎng)陽性率僅14.29%。結(jié)核病初治病例在鏡檢和培養(yǎng)陽性率明顯高于復治病例，藥敏實驗分析發(fā)現(xiàn)復治病例的單藥和多藥耐藥率明顯高于初治病例。復治病例由于沒有規(guī)范、長期、按時、足量地進行抗結(jié)核治療導致耐藥情況嚴峻。

根據(jù)不同分型技術的研究結(jié)果：目前全世界流行的結(jié)核病主要是由幾種特殊的結(jié)核分枝桿菌引起的，并且不同的基因家族具有不同的分子特征、地區(qū)性分布和致病性。北京基因型菌株具有更強的毒力、傳播力，且與耐藥性有關，因此對“北京家族”菌株的鑒定和研究將對結(jié)核桿菌的傳播規(guī)律、耐藥性等生物學特征的研究產(chǎn)生重要意義[6，7]。本研究中發(fā)現(xiàn)煤礦從業(yè)人員結(jié)核分枝桿菌北京基因型占所有分離菌株的63.72%，耐藥情況分析發(fā)現(xiàn)北京基因型的單藥和多藥耐藥率明顯高于非北京基因型菌株。說明在煤礦從業(yè)人員中結(jié)核分枝桿菌北京基因型是主要流行的菌株，并且其耐藥率要遠遠高于非北京基因型菌株。

本研究中所有病例均有過煤礦從業(yè)史，由于其特殊的相當封閉的工作環(huán)境，導致煤礦從業(yè)人員的塵肺和肺結(jié)核的發(fā)病率要明顯高于普通人群。并且由于職業(yè)疾病的存在(塵肺、矽肺等)加上經(jīng)濟因素的影響[8]，導致煤礦從業(yè)人員結(jié)核病的治療效果不佳而出現(xiàn)耐藥率明顯增加的情況。應加強對煤礦從業(yè)人員結(jié)核病防治的管理，嚴格控制耐藥菌株的出現(xiàn)，尤其是要重點監(jiān)控復治患者的管理。

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Analysis on TB epidemic strains and drug resistance of coal mine employees in southern Hunan

Wang Liya
Wuling District Center for Disease Control and Prevention,Changde City of Hunan Province 415000

Objective:To investigate the prevalence of TB among southern Hunan coal mine workers,and mycobacterium tuberculosis epidemic and drug resistance,in order to provide a basis for prevention and treatment on tuberculosis of the coal mine employees.Methods:Tuberculosis sputum specimens with region's diagnosis in coal mine employment history(more than 1 years) were collected,then we detected and isolation of anti tuberculosis drug resistance.Results:A total of 436 sputum samples were collected.The positive rate of microscopic examination was 39.91%;the positive rate of culture was 25.92%;the rate of drug resistance was 25.66%.The positive rate of microscopic examination and culture in the primary cases group were higher than those in the retreatment group,and the rate of single drug resistance and multidrug resistance also lower than those in the retreatment group.Conclusion:Beijing genotype of mycobacterium tuberculosis infection was the main type among local coal mine workers with tuberculosis,and drug resistance rate in the retreatment group was significantly higher than in the primary cases group,so TB prevention and control should be strengthen among coal mine workers.

Mycobacterium tuberculosis;Drug resistance;Coal mine workers;Beijing genotype

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.4.4