劉超群+吳楊+張薇+徐長君+寶力德

摘要：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系統(tǒng)中重要的一種酶。通過研究采油污水對生物體內SOD活性的影響，可以判斷采油污水對生物體產生的毒害以及對環(huán)境產生的污染。本實驗采用斑馬魚為實驗材料，通過比色法和酶液提取技術，以不同濃度的采油污水脅迫培養(yǎng)斑馬魚，然后測定斑馬魚的頭部、肌肉和內臟中SOD活性。實驗結果顯示，在采油污水脅迫培養(yǎng)的斑馬魚體內的sOD活性的變化與污水的濃度也就是污染物脅迫強度有著一定的關系。其中以斑馬魚頭部的SOD活性變化最為顯著，在無采油污水脅迫的對照組中斑馬魚頭部的SOD活性為16.73U/mg，而在采油污水稀釋濃度為0.03的全致死組中培養(yǎng)的斑馬魚頭部的SOD活性為239.09U/mg。說明在沒有采油污水污染的情況下斑馬魚的SOD基礎活性比較低，在全致死濃度時其活性在斑馬魚頭部中上升了14倍左右，變化非常明顯。因此可以通過檢測斑馬魚頭部的SOD活性的變化去判斷斑馬魚是否受到水中污染物的毒害，進而判斷環(huán)境污染的程度。為環(huán)境檢測提供實驗依據，為采油污水的綜合化處理和環(huán)境污染的治理提供簡便的檢測手段。另外本研究發(fā)現(xiàn)在大慶地區(qū)采油污水中斑馬魚全致死濃度為該污水的33倍稀釋濃度，反映出目前大慶地區(qū)的水源被采油污水污染較嚴重。采油污水的排放質量不達標，急需加強對采油污水的排放進行治理，改善大慶地區(qū)水源環(huán)境質量。

關鍵詞：采油污水；斑馬魚；SOD；環(huán)境污染

中圖分類號：X502 文獻標識碼：A 文章編號：2095—672Xf2016）06—0072—05

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2016.06.016

引言

現(xiàn)今，隨著人類對石油資源的不斷開采，產生了大量的采油污水，并對環(huán)境造成了嚴重的污染。大慶作為我國重要的石油基地，同樣面臨著此種情況。為了保證石油的產量，新采油技術不斷的開發(fā)，我國的石油污染狀況和性質也發(fā)生了巨變。采油污水主要來自于石油生產過程中注采不平衡時所產生的污水，以及油氣集輸裝置檢修和沖洗管線時所產生的污水，該污水成分較復雜，其中的污染成分來源于采油生產的各個生產工序。采油污水中主要成分是：原油、地層中的鹽類、氣體、懸浮物、化學藥劑、微生物等。采油污水是否會對環(huán)境產生污染、對生態(tài)產生破壞，引起人們的廣泛關注。

斑馬魚（Danio rerio）是一種體型較小生活在熱帶的魚類。其身體近似紡錘形，成年斑馬魚體長約5cm，身體兩側有銀色斑紋，身體背部呈橄欖色，在身體的其他部位還有與其相同的斑紋。斑馬魚還具有繁殖快、數量多、便于獲取培養(yǎng)、易成活等優(yōu)點。水生生態(tài)環(huán)境的污染對斑馬魚產生的影響較明顯，故本實驗選用斑馬魚作為檢測采油污水對水質污染程度的生物檢測的實驗魚。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系統(tǒng)中重要的一種酶，廣泛存在于動、植物的細胞中，其功能主要是清除細胞中的超氧陰離子游離基，將其轉化為H₂O₂和O₂，再經過氧化氫酶的作用轉化成水和氧氣。通常情況下在動、植物體中處于動態(tài)平衡。超氧化物歧化酶不僅可清除、阻止因氧游離基對動、植物細胞造成的損害，還能夠及時修復被損害的細胞，并復原游離基對細胞造成的傷害。

當生物體受到環(huán)境脅迫時，表現(xiàn)出SOD活性的變化，測定SOD活性的變化能推斷出生物體受到環(huán)境脅迫的程度。本實驗依據超氧化物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性的大小。在有氧化物質的存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產生O₂，可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O₂，從而抑制甲腙的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。在采油污水中脅迫培養(yǎng)的斑馬魚的SOD活性的變化，反應出了采油污水對水生生物的毒害，進而推斷出采油污水對水生生態(tài)環(huán)境的污染程度。

1材料與方法

1.1實驗材料

實驗材料為斑馬魚，購于大慶市讓胡路區(qū)博奧國際花鳥魚市場。在整個實驗過程中規(guī)定實驗用斑馬魚必須年齡相同、品種相同、大小相同、生理狀況相同，實驗用斑馬魚必須顏色純正、活動自如、無任何外傷、各項生理狀況等完全正常，任何有異常的魚都不可以作為實驗魚。

1.2采油污水的稀釋

采油污水取于油田水處理聯(lián)合站。

取實驗室專用清潔紗布，對采油污水進行過濾，去除其它物質，將最后得到的采油污水濃度規(guī)定為單位1，向其中加去離子水稀釋，得到濃度分別為0.01，0.04，0.07，0.10，0.13，0.16六組濃度，并對每組污水設置一組平行實驗組。

1.2.1試劑的配制

（1）磷酸緩沖液（濃度為0.05 mol/L，pH值為7.8）：取濃度為0.1 mol/L，pH值為7.8的Na3P04緩沖液50mL，將其定容至100mL容量瓶中，充分混勻。并置于4℃冰箱中避光保存，以備后用。

（2）EDTA—核黃素混合液：取濃度為0.1mmol/L的EDTA試劑50mL將其與濃度為2mmol/L的核黃素試劑50mL混合，移入100mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。置于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）Met溶液：取0.3879g的Met粉末，用PBS緩沖液溶解并定容至100mL。

（4）NBT溶液：取0.1533g的NBT粉末，用100mL蒸餾水溶解并定容250mL。

（5）石英砂

1.3確定斑馬魚的致死、半致死濃度

用1000mL燒杯分別裝上述濃度的采油污水，每燒杯中培養(yǎng)8條斑馬魚。再取1000mL燒杯裝相同體積的去離子水分別培養(yǎng)8條斑馬魚，作為對照。把實驗組和對照組燒杯中的水溫調至最適溫度值，從實驗用斑馬魚中隨機抽取出斑馬魚，將其立刻投入燒杯中，每燒杯投入8條斑馬魚。設定一個實驗周期為96h，分別在在24h、48h、72h、96h的時間點觀察并記錄斑馬魚的存活數量，并計算出死亡率，最后根據此數據得出斑馬魚的致死濃度和半致死濃度的大致范圍。斑馬魚是否死亡可根據是否有活動跡象，比如是否呼吸、觸碰其身體后是否游動等，從而判斷斑馬魚是否存活。

根據致死濃度和半致死濃度范圍在將此濃度范圍分成六個濃度梯度，進一步縮小濃度范圍。最終確定斑馬魚的全致死濃度、半致死濃度和1/4致死濃度。

1.4酶液的粗提取

從實驗燒杯中取出斑馬魚，在預冷的條件下，將斑馬魚的頭部、肌肉和內臟分別稱取0.4 g置于研缽中，加入預冷的2mL濃度為0.05mol/L的pH值為7.8的磷酸緩沖液，將其置于冰浴中研磨粉碎后，將其移入容量為10mL的離心管中，然后再用6mL濃度為0.05mol/L的pH值為7.8的磷酸緩沖液對其進行沖洗，并一同倒入同一離心管中。將離心管置于離心機中于10000rpm下離心15min。然后將離心管中的上清液取出，移入10mL容量瓶中定容，然后將其置于4℃下保存，用于測定超氧化物歧化酶的活性。

1.5 SOD活性單位的測定

在560nm波長下，測定不同酶液量的吸光值。通過計算得出抑制NBT光還原的相對百分率。以酶液用量為橫坐標，以抑制NBT光還原相對百分率為縱坐標，繪制出二者相關曲線。從而得出抑制NBT光還原相對百分率為50%時的超氧化物歧化酶的酶液量（μL），并以此規(guī)定為一個酶活力單位（U）。

1.6 NBT法測定SOD活性

將待測組設置成1/4致死濃度（稀釋濃度為0.015）、半致死濃度（稀釋濃度為0.019）和全致死濃度（稀釋濃度為0.03）。并用去離子水做兩組相同對照。取0.3mL蛋氨酸+0.3mL EDTA—核黃素混合溶液+0.3mL NBT+1.5mL磷酸緩沖液（0.05mol/L，pH值為7.8）+0.1mL酶液，混勻。將對照組中的一組試管外側套上略長于試管的避光錫紙。另一對照組置于正常實驗條件下曝光。待其靜止大約25分鐘之后，置于560nm下，測定其OD值。重復進行此實驗三次，實驗結果取平均值。

2結果與討論

2.1采油污水中斑馬魚致死濃度的確定

經測定，斑馬魚的全致死濃度為0.03、半致死濃度為0.019、1/4致死濃度為0.015。

2.2 SOD活性

通過NBT法測定了在不同的采油污水濃度中培養(yǎng)的斑馬魚不同組織提取液中的SOD的酶活性，得出以下數據：

在圖1中分析了斑馬魚體內各部位的SOD活性受不同濃度的采油污水脅迫的變化趨勢。

如表1和圖1所示，在相同的處理時間和環(huán)境條件下，隨著采油污水濃度的增加，斑馬魚體內的SOD活性隨之增大。以斑馬魚頭部為例：對照組SOD活性為16.73U/mg、1/4致死組SOD活性為75.95U/mg、半致死組SOD活性為128.23U/mg、全致死組SOD活性為239.09U/mg。

實驗結果顯示，采油污水對斑馬魚頭部的SOD活性影響最明顯，而內臟中的SOD活性次之，肌肉中的SOD活性最小。這種結果可能是由于鰓是斑馬魚的呼吸器官，通過吸取水中的氧氣進行呼吸，直接與體外環(huán)境進行物質交換，且斑馬魚頭部組織的細胞較易受到污染物的損傷，導致SOD活性增加。而斑馬魚內臟中的心臟與肝臟作為斑馬魚生存的主要代謝中心和解毒中心。心臟的功能是推動血液流動，向組織和器官輸送足夠的血液，以供應氧和營養(yǎng)物質，并帶走代謝的終產物（如二氧化碳、尿素和尿酸等），使細胞維持正常的代謝和功能。而肝臟對來自體內和體外的非營養(yǎng)物質如各種藥物、毒物以及體內某些代謝產物，具有生物轉化作用。通過新陳代謝將它們徹底分解或以原形排出體外，從而起到解毒作用。在本實驗中表現(xiàn)為在采油污水濃度較低時，斑馬魚內臟中的SOD活性變化較大。而隨著采油污水濃度的增加，進入內臟中的大量污染物會反過來抑制斑馬魚內臟的代謝活動，導致斑馬魚內臟中的SOD活性的變化比在低濃度采油污水脅迫培養(yǎng)的斑馬魚內臟中的SOD活性的變化小。采油污水中的大量污染物主要通過斑馬魚內臟的代謝活動進入到斑馬魚的肌肉組織，所以，采油污水濃度的增加對肌肉中SOD活性的變化最小，且斑馬魚肌肉中的SOD活性的變化趨勢與內臟中SOD活性的變化趨勢類似，都是在采油污水濃度較小時，SOD活性變化較大，而隨著采油污水濃度的增加，SOD活性變化較小。

采油污水的污染造成了斑馬魚體內各種細胞的損傷，并產生了更多的超氧陰離子游離基，機體為了消除這些超氧陰離子游離基，產生了SOD活性升高的現(xiàn)象。

3結論

研究發(fā)現(xiàn)，隨著采油污水的濃度不斷增加，斑馬魚體內的SOD活性增大。本實驗通過對不同濃度采油污水脅迫培養(yǎng)后的斑馬魚體內的SOD活性進行分析，可知在無采油污水脅迫的對照組中斑馬魚頭部的SOD活性為16.73U/mg，而在采油污水稀釋濃度為0.03的全致死組中培養(yǎng)的斑馬魚頭部的SOD活性為239.09U/mg。說明在沒有采油污水污染的情況下斑馬魚的SOD的基礎活性比較低，在全致死濃度時其活性在斑馬魚頭部中上升了14倍左右，變化非常明顯。因此可以通過檢測斑馬魚頭部的SOD活性的變化去判斷斑馬魚是否受到水中污染物的毒害，進而判斷環(huán)境污染的程度，為環(huán)境檢測提供實驗依據，為采油污水的綜合化處理和環(huán)境污染的治理提供簡便的檢測手段。另外本研究發(fā)現(xiàn)在大慶地區(qū)采油污水中斑馬魚全致死濃度為該污水的33倍稀釋濃度，反映出目前大慶地區(qū)的水源被采油污水污染較嚴重，采油污水的排放質量不達標，急需加強對采油污水的排放進行治理，改善大慶地區(qū)水源環(huán)境質量。