馬艷弘++鐘小仙++喬月芳++李亞輝++張宏志

摘要：研究建立同時測定珍珠粟直鏈和支鏈淀粉含量的檢測方法，并通過測定分析13個種質(zhì)資源中直鏈與支鏈淀粉含量的變化，為篩選適宜的加工品種提供依據(jù)。根據(jù)雙波長選擇原理和掃描光圖譜，確定直鏈淀粉的測定波長、參比波長分別為634、426 nm，支鏈淀粉的測定波長、參比波長分別為539、763 nm。直鏈淀粉濃度在4～44 mg/L之間（r=0.999 3）、支鏈淀粉濃度在20～120 mg/L（r=0.999 3）之間，其碘復(fù)合物與吸光度呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果表明，13個珍珠粟供試樣品中直鏈、支鏈淀粉的含量分別為16.07%～23.48%、52.34%～73.80%，支鏈淀粉含量差異是引起總淀粉含量差異的主要因素。樣品88、50、59、1-1的品種優(yōu)良，可作為選種栽培、精深加工的優(yōu)選品種。

關(guān)鍵詞：雙波長分光光度法；珍珠粟；直鏈淀粉；支鏈淀粉

中圖分類號： S515.01文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0331-04

收稿日期：2016-04-22

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（12）1005-7]；國家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系鹽城綜合試驗站（編號：CARS-35-31）；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程（編號：SXGC[2015]334）。

作者簡介：馬艷弘（1972—），女，山西中陽人，博士，副研究員，主要從事耐鹽蔬菜食品加工技術(shù)及副產(chǎn)物綜合利用研究。Tel：（025）84390613；E-mail：ma_yhhyy@126.com。

[JP2]珍珠粟（pearl millet），即御谷（Penniseetum glaucum），亦稱美洲狼尾草等，原產(chǎn)于非洲，現(xiàn)已廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，為世界上六大禾谷類作物之一，是位于印度、非洲等半干旱地區(qū)人們的主要雜糧作物。珍珠粟具有生長速度快、莖葉產(chǎn)量高、營養(yǎng)成分高、適應(yīng)性廣、適口性好、抗逆性強等特點，尤其適合在高溫、干旱、鹽堿地區(qū)生長[1]，既是重要的優(yōu)質(zhì)牧草和糧食作物來源[2]，同時也是防風(fēng)固沙、改良土壤的優(yōu)良先鋒草種[3]。我國珍珠粟的栽培歷史悠久，在古代曾將其作為貢品供皇室貴族享用，因而珍珠粟也有“御谷”之稱，但是真正從事珍珠粟的研究僅始于20世紀40年代。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，目前已陸續(xù)培育、鑒定、引進包括寧牧26-2美洲狼尾草、寧雜3號美洲狼尾草、寧雜4號美洲狼尾草等國家審定品種在內(nèi)的300多份品種資源，栽培面積逐年增加，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)、工業(yè)造紙、生物能源等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用[4-5]。

珍珠粟種子營養(yǎng)豐富，不僅含有大量淀粉，而且還含有比小麥、大米、玉米、高粱更高含量的蛋白、脂肪和鈣、鐵、鋅等營養(yǎng)成分[6]。此外，珍珠粟還含有豐富的膳食纖維、多酚和黃酮等生物活性物質(zhì)[7]，具有清除自由基、抗氧化[8-9]、預(yù)防糖尿病、抗癌、預(yù)防便秘、控制血壓和低密度脂蛋白水平等生物學(xué)功能[10-11]，可作為預(yù)防多種疾病發(fā)生的重要食療策略[12]。但是遺憾的是，迄今為止國內(nèi)學(xué)者對珍珠粟的研究僅集中在栽培育種和莖葉的飼料發(fā)酵方面，而對珍珠粟作為雜糧的營養(yǎng)特性、食用品質(zhì)、檢測技術(shù)等方面的研究卻未見報道。

淀粉是珍珠粟最主要的食用成分，其含量和組成對其功能、營養(yǎng)及食味特性與加工品質(zhì)影響較大[13]。差示掃描量熱儀法（簡稱DSC）、高效空間排阻色譜法（簡稱HPSEC）、近紅外光譜法（簡稱NIR）、熱重法（簡稱TG）、酶法、雙波長比色法、三波長檢測法[14-15]均可用于淀粉的檢測。這些方法有的操作繁瑣，有的易受樣品中糖類、脂類等物質(zhì)干擾，有的雖然精確，但是檢測成本高、結(jié)果計算復(fù)雜，使其應(yīng)用均受到不同程度的限制。其中，雙波長比色法因具有簡便快速、成本低、準確度高并可同時檢測支鏈、直鏈淀粉等特點而在植物淀粉檢測中備受關(guān)注[16-18]。本研究采用雙波長比色法同時測定不同資源珍珠粟中直鏈、支鏈淀粉的含量，在建立同時測定珍珠粟中支鏈、直鏈淀粉含量的可靠分析技術(shù)的同時，進一步分析不同種質(zhì)資源珍珠粟淀粉組分比例間的差異，為進一步開展珍珠粟雜交育種、品質(zhì)分析、保健食品開發(fā)以及資源的綜合利用提供參考。

[BT1-*3]1材料與方法

1.1材料與試劑

供試珍珠粟資源：采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地，均為通過美國引進的Bil3B綜合種套袋自交后采集的具有不同特性的種質(zhì)資源。種子自然干燥后，用萬能粉碎機粉碎，儲存于封口袋內(nèi)并放置于干燥器中保存?zhèn)溆?。直鏈與支鏈淀粉標準品：美國Sigma公司；其余常規(guī)試劑石油醚、氫氧化鉀、鹽酸、碘、碘化鉀均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

碘試劑的配制，稱取18.5 g碘化鉀，溶于少量蒸餾水中，再加6.5 g碘，待溶解后用蒸餾水定容至100 mL，貯存于棕色瓶中備用。

1.2儀器與設(shè)備

D-8紫外可見分光光度計，南京菲勒儀器有限公司；ML204萬分之一天平，梅特勒儀器有限公司；DHG-9076A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FW100萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；SZF-06A粗脂肪測定儀，上海新嘉電子有限公司；FE20 pH計，梅特勒儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1淀粉標準工作液的制備準確稱取各0.100 0 g直鏈淀粉標準品、支鏈淀粉標準品，分別放入100 mL燒杯中，加10 mL 1 mol/L 氫氧化鉀溶液，置于85 ℃水浴中充分攪拌溶解。然后用蒸餾水定容至50 mL，混合均勻，即為2.0 mg/mL直鏈淀粉標準工作液和2.0 mg/mL支鏈淀粉標準工作液。

1.3.2直鏈與支鏈淀粉檢測波長的確定吸取1.0 mL直鏈淀粉標準工作液和0.5 mL支鏈淀粉標準工作液，分別放入100 mL燒杯中，加25 mL蒸餾水，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至3.0，再加入0.05 mL碘試劑，并用蒸餾水定容至 50 mL。室溫下靜置25 min后以蒸餾水為空白對照，分別在紫外-可見分光光度計上進行400～800 nm波段光譜掃描，分別獲得二者的吸收光譜圖，根據(jù)等吸收點作圖法確定直鏈淀粉的測定波長（λ1）、參比波長（λ2），以及支鏈淀粉的測定波長（λ3）、參比波長（λ4）。

1.3.3直鏈與支鏈淀粉標準曲線的繪制分別取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL直鏈淀粉標準工作液于燒杯中，加 25 mL 蒸餾水，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，加0.05 mL碘試劑，用蒸餾水定容至50 mL。室溫下靜置25 min，在波長λ1、λ2下分別測定吸光度D1、D2，以二者的差值ΔD為縱坐標、直鏈淀粉濃度為橫坐標，即可繪制出雙波長直鏈淀粉標準曲線；分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 支鏈淀粉標準工作液于燒杯中，其他操作同直鏈淀粉，根據(jù)結(jié)果即可繪制支鏈淀粉標準曲線。

1.3.4珍珠粟種子的處理與淀粉含量的測定將自然風(fēng)干的珍珠粟種子用萬能粉碎機打成粉末，稱質(zhì)量，置于 60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，測得水分含量W1；稱取1.000 g烘干樣品（m），加入 80 mL 石油醚，加熱回流脫脂4 h，然后放入干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，利用粗脂肪測定儀測定粗脂肪含量W2。再稱取0.100 g脫脂樣品，加入10 mL 1 mol/L氫氧化鉀，于85 ℃水浴中充分攪拌溶解后，用蒸餾水定容至50 mL，靜置20 min后過濾。各品種均取3 mL濾液，加入25 mL蒸餾水，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0，樣品測定液中加 0.05 mL 碘試劑，測定液、空白液均用蒸餾水定容至50 mL。室溫靜置25 min后，以蒸餾水為空白對照，測定各樣品吸光度。根據(jù)直鏈、支鏈淀粉的雙波長標準曲線算出樣品的直鏈、支鏈淀粉含量，二者相加即得烘干樣品總淀粉含量。直鏈淀粉、支鏈淀粉、總淀粉含量計算公式分別如下：

[JZ]直鏈淀粉含量=[SX（]C直×50×50×103×（m×1 000）×（1-W2）[SX）]×100%；

[JZ]支鏈淀粉含量=[SX（]C支×50×50×103×（m×1 000）×（1-W2）[SX）]×100%；

[JZ]總淀粉含量=直鏈淀粉含量+支鏈淀粉含量。

式中：C直、C支分別為根據(jù)直鏈、支鏈淀粉標準曲線計算的樣品液中直鏈、支鏈淀粉濃度，mg/mL。

1.3.5雙波長法的測定穩(wěn)定性、測定精度與加標回收率試驗分別取直鏈、支鏈淀粉標準液，每隔5 min測定1次吸光度，計算平均值、相對標準偏差RSD值，評價雙波長檢測法的穩(wěn)定性；對于同一珍珠粟樣品，同時測定直鏈、支鏈淀粉的含量，進行4次重復(fù)測定，計算結(jié)果的平均值與RSD值，評價其測定精度；在已測得直鏈、支鏈淀粉含量的珍珠粟樣品中，分別添加準確稱量的不同質(zhì)量的直鏈、支鏈淀粉標準品，測定直鏈、支鏈淀粉含量，按照下列公式計算加標回收率及RSD值，以此檢驗雙波長法測定珍珠粟淀粉含量的準確度：

[JZ]加標回收率=（m1-m2 ）/m3×100%。

式中：m1為加標準品后樣品測定的總質(zhì)量，g；m2為樣品中原有直鏈或支鏈淀粉的質(zhì)量，g；m3為添加的直鏈或支鏈淀粉標準品的質(zhì)量，g。

2結(jié)果與分析

2.1直鏈、支鏈淀粉測定波長與參比波長的確定

利用淀粉經(jīng)I2-KI復(fù)合物溶液染色后直鏈淀粉呈藍色、支鏈淀粉呈紫色的原理，將直鏈與支鏈淀粉標準品經(jīng)碘試劑處理后，用紫外-可見分光光度計進行400～800 nm的光譜掃描。由圖1可知，直鏈、支鏈淀粉的最大吸收波長分別為634 nm（λ1）、539 nm（λ3）。按照雙波長測定的等吸收點作圖法，確定直鏈淀粉測定波長為634 nm（λ1），參比波長為 426 nm（λ2）；支鏈淀粉測定波長為539 nm（λ3），參比波長為763 nm（λ4）。

[TPMYH1.tif]

2.2直鏈、支鏈淀粉標準曲線的繪制

采用雙波長分光光度計法，分別于已確定的雙波長條件下測定不同濃度直鏈、支鏈淀粉標準工作液的吸光度。根據(jù)測定結(jié)果繪制的直鏈、支鏈淀粉標準曲線分別如圖2、圖3所示，所得直鏈淀粉的回歸方程為y直=19796 0x-0.050 3，[JP3]r2=0.999 3；支鏈淀粉的回歸方程為y支=5.000 0x-0.021 3，r2=0.999 3。結(jié)果表明，直鏈淀粉濃度在4～44 mg/L之間， 支鏈

[FK（W10][TPMYH2.tif]

淀粉濃度在 20～120 mg/L之間，其碘復(fù)合物與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3不同資源珍珠粟種子的淀粉含量變化

由表1可見，供試樣品水分含量為7.92%～9.48%，脂肪含量為5.43%～8.27%；烘干樣品中直鏈淀粉含量為1607%～23.48%，[CM（17*2]支鏈淀粉含量為52.34%～73.80%，總[CM）]

[FK（W10][TPMYH3.tif]

淀粉含量為71.11%～90.55%；品種間支鏈淀粉變異系數(shù)（10.27%）大于直鏈淀粉的變異系數(shù)（9.80%），表明珍珠粟種子間總淀粉差異主要由支鏈淀粉引起；品種間支鏈、直鏈淀粉含量比的變異系數(shù)最大（15.83%），表明不同品種珍珠粟種子的食用與加工特性有較大差異，其中樣品1-1的直鏈淀粉含量最低，支鏈淀粉含量最高。

2.4雙波長法的測定穩(wěn)定性試驗

取直鏈淀粉、支鏈淀粉標準液，每隔5 min測定1次吸光度。從表2可見，直鏈、支鏈淀粉溶液在所測時間范圍內(nèi)測定值的相對偏差RSD<1%，15～30 min內(nèi)檢測結(jié)果基本穩(wěn)定，表明試驗重復(fù)性好，雙波長法的檢測結(jié)果相對穩(wěn)定。

2.5雙波長法測定精確度評價

選擇50、69、1-1樣品，經(jīng)脫水、脫脂處理后對其中的直鏈、支鏈淀粉含量分別進行4次重復(fù)測定，由表3可見，4次試驗值之間的一致性較好，3個樣品的直鏈、支鏈淀粉的RSD均小于1%，表明采用雙波長法同時測定珍珠粟淀粉樣品中直鏈、支鏈淀粉具有較高的精確度。

2.6樣品加標回收率測定結(jié)果

為了檢測珍珠粟資源種子中淀粉含量測定結(jié)果的準確性，在已測得直鏈、支鏈淀粉含量的樣品中，選擇88號樣品，添加準確稱量的直鏈、支鏈淀粉標準品，求其回收率。由表4可見，直鏈、支鏈淀粉其回收率在95.00%～98.29%之間，RSD均小于1.5%，滿足檢測要求，說明該分析檢測方法具有較高的準確度，適用于同時測定珍珠粟種子樣品中的直鏈、支鏈淀粉含量。

3結(jié)論

雙波長比色法是一種相對準確、穩(wěn)定、被廣泛應(yīng)用于植物淀粉含量精細檢測的快速檢測方法。本研究利用碘試劑與淀粉發(fā)生的顯色反應(yīng)，建立了采用雙波長分光光度法同時測定珍珠粟直鏈與支鏈淀粉含量的快速檢測方法。由其光譜掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，珍珠粟直鏈淀粉的測定波長、參比波長分別為634、426 nm，支鏈淀粉的測定波長、參比波長分別為539、763 nm；直鏈淀粉濃度在4～44 mg/L之間線性良好，支鏈淀粉濃度在20～120 mg/L之間線性良好。此方法精密度高、穩(wěn)定性好（RSD均小于1.00%）、樣品加標回收率在95.00%～9829%之間，且相對標準偏差?。≧SD小于1.5%），可用于珍珠粟直鏈、支鏈淀粉含量的準確檢測。

禾谷類作物中直鏈與支鏈淀粉的含量與比例會直接影響作物的色澤、香氣、柔軟性等食用品質(zhì)與出飯率、貯藏加工特性[19]。有研究認為，含有中等偏低直鏈淀粉含量的品種或支鏈淀粉含量高的品種的品質(zhì)較好[20-21]。本研究在建立珍珠粟淀粉雙波長法檢測基礎(chǔ)上，對不同品種珍珠粟中直鏈淀粉、支鏈淀粉進行測定，結(jié)果表明：供試不同珍珠粟種質(zhì)資源的食用加工特性有較大差異，直鏈、支鏈淀粉的含量分別為 16.07%～23.48%、52.34%～73.80%，總淀粉含量為 71.11%～90.55%，支鏈淀粉含量差異是總淀粉含量差異的主要因素，其變異系數(shù)（10.27%）高于直鏈淀粉含量的變異系數(shù)。樣品88、50、59、1-1的品種優(yōu)良，直鏈淀粉含量較低、支鏈淀粉含量較高，可作為選種栽培、精深加工的主要品種。

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