摘要：結(jié)合黃瓜基因組數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析，采用同源擴(kuò)增技術(shù)從黃瓜津研4號(hào)葉片中獲得1個(gè)受缺銅誘導(dǎo)表達(dá)的基因，命名為CsSPL7。該基因全長(zhǎng)1 746 bp，編碼582個(gè)氨基酸，與擬南芥SPL7基因序列相似性為43%。QRT-PCR表達(dá)分析表明，CsSPL7是1個(gè)受缺銅誘導(dǎo)表達(dá)的基因，在缺銅處理的黃瓜葉片中表達(dá)量最高，并且隨著銅處理濃度的升高，其表達(dá)量逐漸降低。研究結(jié)果為下一步分析CsSPL7在黃瓜缺銅脅迫過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：CsSPL7基因；黃瓜；銅；QRT-PCR；同源克隆

中圖分類號(hào)： S642.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0088-03

收稿日期：2015-10-19

基金項(xiàng)目：黑龍江省青年科學(xué)基金（編號(hào)：QC2010089）。

作者簡(jiǎn)介：杜亞琳（1980—），女，河南郾城人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閳@藝作物生物技術(shù)。E-mail：duyalin123@163.com。

銅（Cu）是植物生長(zhǎng)和發(fā)育必需的微量元素，許多代謝過程，例如光合作用、線粒體電子傳遞、呼吸作用、活性氧代謝、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變以及乙烯反應(yīng)等，均需要銅作為輔助因子[1-2]。由于銅在發(fā)育過程中的重要意義，銅動(dòng)態(tài)平衡在植物體內(nèi)處于一種精細(xì)調(diào)控的狀態(tài)。植物體內(nèi)的銅濃度在不同物種以及不同外源銅環(huán)境條件下存在一定差異[3]。

目前，人們通過對(duì)植物銅缺失突變體的研究，已經(jīng)初步明確植物對(duì)銅的吸收和積累機(jī)制。缺銅脅迫條件下，植物通過調(diào)控銅吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)獲得了精細(xì)調(diào)控體內(nèi)銅動(dòng)態(tài)平衡的機(jī)制[4-5]。例如擬南芥通過提高銅的吸收和獲取量來應(yīng)對(duì)缺銅脅迫。缺銅脅迫會(huì)上調(diào)擬南芥銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，如ZIP2、ZIP4、FRO3等[6-7]。此外，缺銅脅迫時(shí)，在轉(zhuǎn)銅伴侶CCH基因作用下，衰老過程中銅會(huì)在各組織間重新分配[8]。此外，研究表明，擬南芥SPL7是植物缺銅反應(yīng)過程中的一個(gè)核心調(diào)控因子，在低銅條件下，銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（COPT1、COPT2、ZIP2、YSL2）、轉(zhuǎn)銅伴侶基因（CCH、CCS）、FRO3、FRO4、FRO5和FSD1在spl7突變體中也均調(diào)控失衡[9-10]。此外，一些新鑒定出的缺銅響應(yīng)蛋白同樣受到SPL7的調(diào)控[10]。上述有關(guān)植物吸收和積累銅機(jī)制研究，暗示SPL7在植物響應(yīng)缺銅脅迫過程中的重要調(diào)控作用，為深入研究農(nóng)作物（如黃瓜）銅脅迫的生理與分子機(jī)制鑒定了基礎(chǔ)。

黃瓜為一種重要的蔬菜作物，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)對(duì)含重金屬材料的使用，以及排放的化學(xué)物質(zhì)種類、數(shù)量的增加，重金屬（如銅）污染的土壤面積日益擴(kuò)大，使環(huán)境污染日益嚴(yán)重，造成農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降、優(yōu)良品種退化迅速，從而制約農(nóng)業(yè)的發(fā)展，進(jìn)而會(huì)威脅生態(tài)安全，影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，并通過食物鏈危及人類健康。盡管人們對(duì)植物缺銅響應(yīng)機(jī)制的相關(guān)研究取得了較大進(jìn)展，但是目前人們?nèi)圆荒芮逦U述銅脅迫條件下植物（如黃瓜）調(diào)控銅動(dòng)態(tài)平衡的生理與分子機(jī)制。通過基因工程改造植物基因培育高生物產(chǎn)量的重金屬超積累植物是一個(gè)可行的途徑，要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，首先要明確植物對(duì)銅的吸收積累機(jī)制。因此，探討黃瓜耐銅脅迫生理與分子機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究擬克隆黃瓜CsSPL7基因，并對(duì)其序列和在缺銅脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，從而為后續(xù)利用基因工程技術(shù)研究該基因的功能及培育耐銅脅迫的黃瓜新品種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為黃瓜津研4號(hào)，購(gòu)自天津科潤(rùn)黃瓜研究所。2015年春季在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站人工氣候室內(nèi)常規(guī)種植。在苗期，分別取同一植株的葉片（最頂部幼嫩葉片），用液氮冷凍并于-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.2銅處理

黃瓜植株采用水培方式進(jìn)行栽培。采用MGRL營(yíng)養(yǎng)液配方[含1.512 mmol/L NaH2PO4·2H2O、0.257 mmol/L Na2HPO4·12H2O、1.5 mmol/L MgSO4·7H2O、2.0 mmol/L Ca（NO3）4·4H2O、3.0 mmol/L KNO3，67 μmol/L Na2EDTA·2H2O、8.6 μmol/L FeSO4·7H2O、10.3 μmol/L MnSO4、1.0 μmol/L ZnSO4.7H2O、30 μmol/L H3BO3、24 nmol/L（NH4）6Mo7O24·4H2O、130 nmol/L CoCl2·6H2O]，分別添加不同濃度的CuSO4（0、1、5、25、50 μmol/L）進(jìn)行處理，3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。

1.3總RNA的提取及單鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄

總RNA的提取采用TRIzol（Invitrogen）法進(jìn)行，具體操作參照說明書。隨后用RNase Free DNase I（TaKaRa）處理總RNA，以去除殘留的基因組DNA。單鏈cDNA合成采用MBI公司的逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）進(jìn)行，具體操作參考試劑盒說明書。

1.4黃瓜CsSPL7基因的克隆

根據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果，選取擬南芥SPL7（AT5G18830）基因，在Tair（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站搜索其基因序列，并將其基因序列在黃瓜基因組（http：//www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome/cuke.cgi）網(wǎng)站中進(jìn)行比對(duì)，獲取其在黃瓜中的同源序列，進(jìn)而以黃瓜基因組中基因同源序列為模板，利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)特異引物（正義引物：5′-ATGGAAAGTGATCGATCAAGCATGC-3′；反義引物：5′-TTACAACTTATCTATCAAGCATCTG-3′），以黃瓜津研4號(hào)幼嫩葉片cDNA為模板，擴(kuò)增黃瓜SPL7基因全長(zhǎng)cDNA序列。擴(kuò)增產(chǎn)物采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司DNA凝膠回收試劑盒回收，插入pGEM-T Easy載體（美國(guó)Promega公司），熱激法轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素平板上進(jìn)行陽性克隆篩選，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

[BT2+*5]1.5生物信息學(xué)以及熒光定量PCR（簡(jiǎn)稱QRT-PCR）分析

將克隆獲得的CsSPL7基因序列在NCBI中進(jìn)行同源比對(duì)分析。同時(shí)以經(jīng)不同銅濃度處理的黃瓜津研4號(hào)葉片為材料，以黃瓜CsSPL7基因的cDNA序列為基礎(chǔ)，利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)特異引物（正義引物：5′-GGGCAACATACTTGTTTAC-3′；反義引物：5′-GTCAAGATACTTTCCACCA-3′），以β-actin作為內(nèi)參，用于黃瓜CsSPL7基因的QRT-PCR分析。QRT-PCR反應(yīng)總體系為20 μL，包括10 μL Real Master Mix SYBR Green Ⅰ[天根生化科技（北京）有限公司]、各1 μL特異引物（20 μmol/L）、0.5 μLcDNA模板、7.5 μL ddH2O。實(shí)時(shí)定量PCR所使用儀器為IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀（伯樂公司），試驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT方法來計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1黃瓜CsSPL7基因的克隆與序列分析

以擬南芥SPL7在黃瓜基因組中的同源基因序列為參考，設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增獲得CsSPL7同源基因全長(zhǎng)cDNA序列。結(jié)果成功擴(kuò)增出1條約1 700 bp的單一條帶，測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 746 bp，編碼582個(gè)氨基酸（圖1）。對(duì)其進(jìn)行Blast分析表明，其與擬南芥SPL7基因的序列相似性為43%（圖2）。

[FK（W+135mm][TPDYL1.tif]

2.2黃瓜CsSPL7基因的組織表達(dá)分析

以β-actin作為內(nèi)參標(biāo)定，以經(jīng)不同銅濃度處理的黃瓜津研4號(hào)葉片為材料，以黃瓜CsSPL7基因cDNA全長(zhǎng)序列為模板設(shè)計(jì)特異引物，利用QRT-PCR對(duì)CsSPL7進(jìn)行表達(dá)特征分析。結(jié)果表明，CsSPL7在缺銅處理的黃瓜葉片中的相對(duì)表達(dá)量最高，而隨著銅處理濃度的增加，其表達(dá)量則逐漸下降（圖3），證明CsSPL7是1個(gè)受缺銅誘導(dǎo)表達(dá)的基因。

3討論

本研究通過生物信息學(xué)分析和同源克隆技術(shù)，從黃瓜葉片中克隆得到植物缺銅核心調(diào)控因子SPL7的同源基因CsSPL7，并對(duì)其序列和表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，CsSPL7是1個(gè)缺銅誘導(dǎo)表達(dá)基因。人們發(fā)現(xiàn)從萊茵衣藻銅反應(yīng)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子CRR1啟動(dòng)子區(qū)鑒定出來的GTAC核心調(diào)控元件只是在植物Cu-microRNAs和FeSOD基因啟動(dòng)子中被頻繁檢測(cè)到，暗示其在缺銅脅迫下的銅動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控過程中可能發(fā)揮重要作用[2]。缺銅脅迫信號(hào)通過擬南芥GTAC調(diào)控元件激活了miR398b、miR398c的轉(zhuǎn)錄活性，而位于185～182 bp或者 157～154 bp的GTAC核心調(diào)控元件足以調(diào)控缺銅脅迫[9]。后續(xù)結(jié)果表明，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子基因SPL7與萊茵衣藻CRR1具有高度同源性[11]。進(jìn)一步分析表明，SPL7是植物缺銅脅迫下的1個(gè)保守的核心調(diào)控因子。SPL7能夠直接與miR398啟動(dòng)子區(qū)GATC調(diào)控元件結(jié)合[9]，即使是在低銅條件下，啟動(dòng)子區(qū)擁有GTAC調(diào)控元件的植物銅動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)Cu-microRNAs在spl7突變體中也均不能正常表達(dá)。上述有關(guān)植物吸收和積累銅機(jī)制研究，為深入研究黃瓜CsSPL7基因的生理與分子機(jī)制鑒定了重要基礎(chǔ)。

相對(duì)于模式植物擬南芥的研究[9]，目前黃瓜耐銅脅迫相關(guān)基因分子調(diào)控機(jī)制的研究尚處在起步階段，而對(duì)黃瓜耐銅脅迫相關(guān)基因的分子機(jī)制的研究還較少。隨著黃瓜及各種園藝作物基因組測(cè)序的完成，結(jié)合生物信息學(xué)分析，加快了不同種間同源基因的克隆，如以擬南芥相關(guān)基因信息來克隆黃瓜中的同源基因。本研究即依托黃瓜基因組序列信息，利用生物信息學(xué)分析，在較短時(shí)間內(nèi)獲得黃瓜CsSPL7的全長(zhǎng)序列。因此，黃瓜基因組測(cè)序?qū)嵤┑耐瓿?，在很大程度上促進(jìn)了黃瓜耐銅相關(guān)基因分子調(diào)控機(jī)制方面的研究。

雖然植物SPL7家族中的一些基因已有廣泛研究，但有一些問題仍然沒有解決。例如，除了轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以外，植物SPL7家族（例如CsSPL7等）是否還有其他功能？以及作為一種微量元素，同時(shí)又作為一種調(diào)節(jié)信號(hào)，黃瓜缺銅信號(hào)如何調(diào)控黃瓜植株的生長(zhǎng)和發(fā)育？由于這些相關(guān)分子機(jī)制還不清楚，在接下來的工作中，筆者將通過功能互補(bǔ)試驗(yàn)、基因敲除試驗(yàn)等對(duì)CsSPL7的功能進(jìn)行研究，同時(shí)計(jì)劃對(duì)其啟動(dòng)子序列進(jìn)行克隆與分析，以期能夠幫助人們理解黃瓜耐缺銅脅迫的生理與分子機(jī)制。

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