王志恒 趙 超 陳曉勇 劉亞娟 葛 劍 趙鎖林 趙建立
(1.石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心,河北石家莊 050041;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定 071000;3.河北畜牧獸醫(yī)研究所,河北保定 071000;4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定 071000;5.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河北張家口 075000;6.石家莊市藁城區(qū)畜牧水產(chǎn)局畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)站 河北石家莊 050000;7.石家莊市石藥集團(tuán)新諾威制藥股份有限公司,河北石家莊 051430)
豬肉及組織中β-受體激動(dòng)劑UPLC-MS/M檢測(cè)方法研究
王志恒1趙 超2陳曉勇3劉亞娟4葛 劍5趙鎖林6趙建立7
(1.石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心,河北石家莊 050041;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定 071000;3.河北畜牧獸醫(yī)研究所,河北保定 071000;4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定 071000;5.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河北張家口 075000;6.石家莊市藁城區(qū)畜牧水產(chǎn)局畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)站 河北石家莊 050000;7.石家莊市石藥集團(tuán)新諾威制藥股份有限公司,河北石家莊 051430)
超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測(cè)豬肉中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇3種β-受體激動(dòng)劑殘留方法。選用鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解,混合型陽(yáng)離子交換固相萃取凈化,以 0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液-甲醇為流動(dòng)相,超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè),在 1.0、5.0、10μg/kg濃度添加水平,空白肌肉組織中3 種藥物添加平均回收率范圍84~95%,標(biāo)準(zhǔn)偏差3.6~8.1%。該方法檢測(cè)限為 0.1 μg/kg,定量限為 0.3μg/kg,具有準(zhǔn)確敏感特性。
β-受體激動(dòng)劑;殘留檢測(cè);超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法
20世紀(jì)80年代初,美國(guó)一家公司開始將鹽酸克倫特羅添加到飼料中,達(dá)到提高瘦肉率的作用,從此β-受體激動(dòng)劑被熟稱為“瘦肉精”。β-受體激動(dòng)劑的“再分配效應(yīng)”使動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分由脂肪組織向肌肉組織轉(zhuǎn)移,從而達(dá)到減少胴體脂肪含量,提高瘦肉率的作用。其作用機(jī)制:(1)降低脂肪含量。進(jìn)入機(jī)體的β-受體激動(dòng)劑與脂肪細(xì)胞膜上的β-受體結(jié)合后,增加胞內(nèi)環(huán)磷酸腺(cAMP),從而加速了脂肪細(xì)胞三酰基甘油的降解[1]。另外β-激動(dòng)劑能促進(jìn)脂肪的分解和抑制脂肪的合成[2]。(2)提高肌肉含量。β-激動(dòng)劑還能促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌和釋放,促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)[3]。
但如果作為飼料添加劑,使用劑量是人用藥劑量的5-10倍,才能達(dá)到提高瘦肉率的效果。若人體誤食了含有此類藥物的食品,會(huì)產(chǎn)生頭暈,頭疼,心跳加快,肌肉震顫,口干,惡心,嘔吐等癥狀,對(duì)高血壓,心臟病病人危害更大[4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中將克倫特羅及其鹽、沙丁胺醇及其鹽和酯、西馬特羅及其鹽和酯列為禁止使用的獸藥,并規(guī)定在動(dòng)物食品中不得檢出。本研究對(duì)豬肉組織酶解,高氯酸:甲醇(9:1,v/v)提取,經(jīng)混合型的PCX柱凈化后,采用UPLC—MS/MS的多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)進(jìn)行檢測(cè)。另外本研究對(duì)基質(zhì)誘導(dǎo)的離子抑制作用進(jìn)行了討論,建立了較好的實(shí)驗(yàn)方案。
超高效液相色譜系統(tǒng):ACQUITY Ultra Performance Liquid Chromatography 19(UPLC)(日本島津公司);質(zhì)譜系統(tǒng):質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司),串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(MS-MS);色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(50x2.1mm i,d 1.7μm):固相萃取小柱:Bond Elut Plexa PCX(3mL,60mg):乙腈,甲醇、乙酸乙酯、甲酸、冰乙酸、醋酸銨等為進(jìn)口色譜純;標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:克倫特羅,沙丁胺醇,萊克多巴胺,純度99.5%,購(gòu)于Dr.Ehrcnstorfcr。使用甲醇配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-20℃下棕色瓶中保存。
稱取2.0 g勻質(zhì)好的豬肉樣品于50mL離心管中,加入5.0 ml乙酸銨緩沖溶液(2.0 M,pH 5.2),再加入50μlβ-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶,渦旋混勻后于37℃下溫育過夜酶解。酶解后的樣品加入10 ml 0.2 mol/L高氯酸.甲醇(9:1,v/v)的混合液后渦旋混勻3 min。然后在4℃以8000轉(zhuǎn)/min的速度離心15 min,取上層液過濾到濾膜。殘留物經(jīng)高氯酸-甲醇(9:1,v/v)的混合液重復(fù)提取一次,合并過濾液待凈化。首先依次用3 ml甲醇,3 ml水活化PCX固相萃取柱,全部上樣后,再依次用3 ml水,3 ml甲醇淋洗,抽至近干后,最后用3 ml含有5%氨水的甲醇溶液進(jìn)行洗脫,收集洗脫液于60℃下的氮?dú)庀麓蹈?,使用初始的流?dòng)相定容到2.0ml,過0.22μm的濾膜待UPLC- MS/MS分析。
色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50x2.1mm i.d 1.7μm);柱溫:40℃;樣品室溫度:20℃;進(jìn)樣體積:5.0μL;流動(dòng)相:A相為含0.1%甲酸的水溶液(甲酸:水=0.1:100,V:V),B相為甲醇;線性梯度洗脫程序:0 min時(shí)A為80%,3 min時(shí)A為45%,3.5 min時(shí),A為80%;流速:0.20 mL/min;檢測(cè)時(shí)間:3.5 min。
離子模式(Ionization Mode):電噴霧正離子源ESI+;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);源內(nèi)毛細(xì)管電壓:3.5KV;樣品錐孔電壓:50V;離子源溫度:110℃;脫溶劑溫度:400℃;錐孔反吹氣;錐孔反吹氣流量:93L·Hr-l;光電倍增管電壓:650V;
本實(shí)驗(yàn)的酶解方法,即在2.0 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH 5.2)中加入50μlβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解,37℃溫育過夜。
豬肉組織基質(zhì)中的蛋白質(zhì)對(duì)電噴霧質(zhì)譜的離子抑制作用很強(qiáng),使靈敏度明顯降低。為了沉淀豬肉組織中的蛋白質(zhì),本實(shí)驗(yàn)采用0.1%高氯酸一甲醇((9:l,v/v)對(duì)酶解后的樣品進(jìn)行提取,使蛋白質(zhì)達(dá)到等電點(diǎn)沉淀,從而減少了蛋白質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的干擾。
本研究起初嘗試使用液液萃?。↙LE)凈化,使用Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱是一種混合型的陽(yáng)離子交換柱,Plexa PCX具有強(qiáng)大的表面親水性,鍵合了磺?;木酆衔锘w的羥基化表面,孔內(nèi)部具有疏水性,這種特性使PCX柱經(jīng)活化后,吸附劑具有獨(dú)特的極性梯度表面,更為重要的是蛋白質(zhì)的表面結(jié)合特性最小。
由于β-受體激動(dòng)劑是一類具有弱極性的化合物,再加上電噴霧電離的高靈敏度,易操作等特點(diǎn),所以電噴霧電離被選擇。首先以10μL/min的流速通過針泵注入1.0μg/ml β-受體激動(dòng)劑單標(biāo)溶液,在正離子電噴霧模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描。遵循豐度高和質(zhì)量數(shù)大兩個(gè)原則選擇母離子,得到分子離子峰【M+H】+最為理想。
根據(jù)歐盟2002/657/EC規(guī)定,β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)確證方法需要4個(gè)鑒別點(diǎn)。一個(gè)母離子己獲得1個(gè)鑒別點(diǎn),還需要兩個(gè)子離子,由每個(gè)子離子獲得1.5個(gè)鑒別點(diǎn)才滿足確證方法的要求。對(duì)每種母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,得到碎片離子信息。當(dāng)碰撞能量較低時(shí),只產(chǎn)生質(zhì)量數(shù)較大分子離子碎片,隨著碰撞能量的增加,碎片離子的數(shù)量增加,如沙丁胺醇產(chǎn)生m/z 148,222;萊克多巴胺產(chǎn)生m/z 164,284;鹽酸克倫特羅產(chǎn)生m/z 203,259。
為了減少基質(zhì)干擾,本文采用向空白基質(zhì)溶液中添加一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為0.5,1.0,2.0,5.O,10.0,20.0μg/kg的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,在O.5~20.0 m/kg的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99。方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)以向空白樣品中添加較低濃度的待測(cè)物進(jìn)行測(cè)定,以信噪比大于3的濃度定義為L(zhǎng)OD,信噪比大于10的濃度定義為L(zhǎng)OQ。
取陰性豬肉試樣加入適量待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液,使最終添加水平為1.O,5.0,10.0μg/kg,每個(gè)添加水平做6個(gè)平行,平均回收率為84-95%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6~8.1%,添加水平為1.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg。
本研究建立了豬肉組織中三種不同極性的β-受體激動(dòng)劑的殘留檢測(cè)方法。2.0 g樣品經(jīng)酶解后,采用高氯酸-甲醇(9:l,v/v)提取并沉淀蛋白質(zhì),混合型的陽(yáng)離子交換柱(Bond Elut Plexa PCX)凈化后,最后再生到2.0 mL。以甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相,采用梯度洗脫,以粒徑為1.7μm的BEH C18柱進(jìn)行分離,在ESI+下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下進(jìn)行檢測(cè),分析時(shí)間只有3.5min。此方法分析時(shí)間短,回收率和檢測(cè)限都令人滿意,還有效的減少了離子抑制現(xiàn)象,可用于日常中豬肉組織中β-受體激動(dòng)劑的殘留檢測(cè)。
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王志恒(1981—),男,河北省石家莊市人,畜牧師,碩士研究生,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)。