趙小勇 馬樹芳 程志偉

（山東省濱州市濱城區(qū)北鎮(zhèn)獸醫(yī)站 256600）

副豬嗜血桿菌潛在毒力因子研究進展

趙小勇 馬樹芳 程志偉

（山東省濱州市濱城區(qū)北鎮(zhèn)獸醫(yī)站 256600）

副豬嗜血桿菌是引起豬格氏病的病原，多繼發(fā)感染引起全身性疾病，其高發(fā)病率和死亡率給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重損失。本文主要對副豬嗜血桿菌的外膜蛋白、莢膜多糖、、菌毛、轉鐵結合蛋白、酶類和毒素等主要毒力因子的相關研究進展進行了綜述。

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)是常規(guī)豬群上呼吸道的一種條件性致病菌，在某些因素的條件下，可突破黏膜屏障，從而引起嚴重的全身性感染，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為主要特征，該菌引起的革拉氏病流行和危害日漸嚴重，嚴重危害仔豬和青年豬的健康(薛國聰和任濤，2009)。隨著養(yǎng)豬集約化程度的提高以及飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)管理的改變，副豬嗜血桿菌病的發(fā)生呈逐年上升的趨勢，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的一種嚴重的細菌性傳染病(張煥容，2010)。由于Hps菌株間存在抗原異質性和毒力的差異(Kielstein和RappGabrielson，1992)，因此，辨別常在菌和毒力菌株是控制和診斷副豬嗜血桿菌病的關鍵，Hps毒力因子的鑒定將為新型疫苗的設計奠定基礎。

1 外膜蛋白(OMP)

（1）Hps的外膜蛋白(OMP)是其重要的毒力因子之一。Ruiz等(2001)研究表明，外膜蛋白與Hps的毒力有關，健康仔豬與患病豬分離的HpsOMP不同，有多發(fā)性漿膜炎和關節(jié)炎癥狀的豬分離的OMP基本相同。OMP蛋白共有8種，大小分別約為92、88、53、60、46、37、31、15ku。Hps強毒株都具有一類分子質量在37ku左右的蛋白質。應用SDS-PAGE技術發(fā)現(xiàn)，副豬嗜血桿菌的OMP具有2個完全不同的生物型：即生物1型和生物2型。由健康豬鼻黏膜分離到的菌株表達的是生物1型OMP，包括兩個蛋白，其分子量一為約68ku；另一蛋白的分子量在23～40ku之間。由副豬嗜血桿菌病病豬分離到的菌株通常含生物2型OMP，其以約37ku的優(yōu)勢蛋白為特征。在副豬嗜血桿菌中發(fā)現(xiàn)了兩個與流感嗜血桿菌具有同源性的外膜蛋白P2和P5，該蛋白與細菌黏附有關，在毒力株和非毒力株中P2蛋白的大小有所不同，在毒力株中為48ku，而在非毒力株中卻為55ku，可通過P2蛋白來區(qū)分毒力株和非毒力株(Olver等，2010)。（2）通過2D電泳和MALDI-TOFMS和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)HpsOMP家族中6個具有強免疫原性的蛋白質，分別是FhuA、OmpA、PalA、OmpP2、D15和HPS-06257，另外Plp4、Wza和Omp5這3個蛋白質因其在相近菌屬的重要性而同樣不能忽視(Zhou等，2009)其中，OmpP2是一種孔蛋白，在Hps外膜中含量最多，且存在2種蛋白結構，并被證明是Hps保護性抗體的靶蛋白，在小鼠攻毒試驗中起部分保護作用，是潛在抗原和毒力因子(Mullins等，2009；)。對HpsSC096株△OmpP2缺失突變株和其互補菌株的研究顯示，OmpP2缺失導致Hps對豬肺泡巨噬細胞(3D4/2)黏附能力降低和細胞外存活細菌數(shù)的減少，可推知OmpP2參與細菌抗吞噬作用，同時缺失株表現(xiàn)生長緩慢，而且在正常豬和兔血清中存活率極低，而互補菌株卻恢復了對血清補體的正常抵抗能力，說明OmpP2與細菌抗補體介導的血清殺菌作用有關(Zhang等，2012)

2 菌毛

（1）HpsSH0165具有4個IV型菌毛基因，編碼主要結構單元PilA(HAPS2013)和3個生物合成蛋白PilB、PilC和PilD(Xu等，2011)。血清4型副豬嗜血桿菌gx033基因組信息顯示其存在pilF基因，該基因編碼一個菌毛生物合成和穿梭運動蛋白(Li等，2013)。（2）Munch等(1992)研究發(fā)現(xiàn)，副豬嗜血桿菌在體內傳代后能夠生成菌毛樣結構，且可從沒有任何臨床癥狀的豬鼻腔內分離到Hps，但其致病作用不清楚。Vahle等(1997)研究表明，從鼻腔中分離的副豬嗜血桿菌與急性化膿性鼻炎、鼻腔和氣管黏膜的急性細胞腫脹及纖毛丟失有關，并推斷黏膜的這些變化可能使副豬嗜血桿菌侵入機體并進入血流，且透射電子顯微鏡和免疫組織化學的結果均顯示纖毛丟失和細胞變性的部位有副豬嗜血桿菌。Hps血清5型Nagasaki株(從患腦膜炎的病豬中分離)能夠以非常高的水平粘附并侵入豬腦微血管內皮細胞(PBMEC)，電鏡照片也證實了這種能力。比較從腦膜炎或肺炎病豬中分離的不同血清型HPS對PBMEC的粘附和侵襲水平，發(fā)現(xiàn)血清4型和5型比其他血清型具有更高的粘附能力。抑制試驗結果表明，Hps侵襲PBMEC需要肌動蛋白微絲和微管骨架重排，蛋白侵襲素在Hps進入PBMEC的過程中似乎并沒有起到主要作用。侵襲血腦屏障的內皮細胞可能是Hps引起腦膜炎的原因(Anna等，2006)。

3 莢膜多糖(CPS)

Perry等(2013)檢測了5型和15型副豬嗜血桿菌的莢膜組成，莢膜結構是由一個二糖重復單元β-六磷酸葡萄糖主鏈和2,4-氨基-2,4,6-三羥基-D-吡咯半乳糖側鏈組成，側鏈在血清15型菌株中被α-Neu5R-3-α-GalNAc-1-P取代，血清5型菌株被α-Neu5R-3-α-Gal-1-P取代，其中R是指N-乙?；騈-羥基。莢膜多糖抗原的成分主要是多糖和磷壁酸，具有型特異性，與細菌毒力有關。Morozulni和Nieolet(1986)報道了自健康豬上呼吸道上分離的大多數(shù)副豬嗜血桿菌具有莢膜，而從其他部位分離的菌株多數(shù)沒有莢膜。通過活體內傳代的方法可篩選出產(chǎn)生莢膜的副豬嗜血桿菌，而在培養(yǎng)基上經(jīng)多次傳代后發(fā)現(xiàn)有莢膜的細菌數(shù)量已然減少(Rapp-Gabrielson和Gabrielson，1992)。莢膜、菌毛、外膜蛋白與巴氏桿菌科的多個成員在上呼吸道定居有關。但是目前Hps的莢膜多糖、全細胞蛋白圖譜及毒力之間的關系尚有爭議。

4 轉鐵結合蛋白(TBP)

（1）從胞外獲取和攝入鐵元素是真核生物生長必不可少的，也是病原菌感染中存活必要條件，細菌進化產(chǎn)生了一些高特異性蛋白在缺鐵環(huán)境中捕獲鐵元素。副豬嗜血桿菌含有的轉鐵結合蛋白可為細菌生長提供必需的鐵離子，轉鐵結合蛋白在副豬嗜血桿菌對宿主動物的感染中發(fā)揮了決定性的作用。轉鐵結合蛋白能夠特異地捕獲宿主的鐵離子，并將其轉運到細菌的細胞漿中，以供細菌生長。轉鐵結合蛋白是位于菌體外膜上特異性結合轉鐵蛋白的受體，它由2種不同的蛋白組成，即轉鐵結合蛋白A(tbPA)和轉鐵結合蛋白B(tbPB)，其中tbPA可能是一種穿膜蛋白，而tbPB的N端脂肪酸殘基鑲嵌在外膜上，通過兩者的共同作用特異性的從宿主動物體內捕獲轉鐵蛋白來獲取鐵離子，以滿足細菌的生長需要。在tbPB基因的上游還有2個共轉錄基因exbB和exbD，其表達產(chǎn)物ExbB和ExbD有助于鐵的獲取(Charfand等，1995)。（2）Martinez等(2010)克隆表達出由200個氨基酸組成的Hps5型重組TbpA蛋白，純化后制備多抗，免疫印跡法證明在缺鐵環(huán)境下培養(yǎng)的Hps、胸膜肺炎放線桿菌(A.pleuropneumoniae)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)提取物中有TbpA蛋白；ELISA結果表明，其對其他巴斯德菌科細菌的TbpA蛋白也反應，說明該重組蛋白可能具有一段免疫顯性區(qū)；血清殺菌活性試驗結果表明，其會引起補體介導的血清殺菌作用；而且通過免疫金標記技術證明了細菌表面的TbpA能夠結合特異性多抗，由此推測TbpA是一種疫苗備選抗原。delRío等(2005)對包含ExbB、TbpB、TbpA蛋白的TonB區(qū)域進行擴增后發(fā)現(xiàn)TbpB在Hps不同血清型之間具有較大差異，而且在鐵缺乏的條件下，ExbB、TbpB、TbpA蛋白表達量有所增多，對Hps重組TbpB蛋白的研究表明，其可能與腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)的TbpB蛋白相同都具有免疫原性。（3）細菌fur基因和鐵吸收相關，Bigas等(2006)通過自然轉化法將攜帶有fur基因的自殺載體導入Hps中，通過同源重組構建fur基因缺失突變株，結果發(fā)現(xiàn)缺失fur基因后菌體不能存活。

5 酶類

（1）神經(jīng)氨酸酶在Hps菌的對數(shù)生長期末期開始表達，其作用是通過與透酶和醛縮酶協(xié)同作用，通過奪取宿主細胞的碳水化合物而增強細菌毒力。除了對營養(yǎng)方面的影響以外，神經(jīng)氨酸苷酶能夠介導清除與宿主細胞糖原結合的唾液酸，從而暴露出細菌定居或侵入宿主細胞所需的受體，并通過降低黏蛋白的黏性從而干擾宿主的防御系統(tǒng)。Carol等(2003)從Hps的細胞膜上抽提純化了神經(jīng)氨酸酶，其分子質量約為82ku；與哺乳動物的大多膜結合神經(jīng)氨酸酶相反，該酶抽提后很穩(wěn)定，證明該酶為一個有潛在毒力的因子，從而進一步推動了Hps致病因子的研究。劉俊琦等(2010)研究了HPS的神經(jīng)氨酸酶基因作為候選基因疫苗的免疫原性，攻毒試驗結果顯示：氫氧化鋁佐劑組的保護性較低，僅有10%，而弗氏佐劑組具有較高的保護性，保護率高達60%。（2）6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-DPG)催化葡萄糖-6-磷酸和水合成6-磷酸葡萄糖酸內酯，是磷酸戊糖途徑的限速酶，同時還可以維持細胞內NADPH含量，這對血管內皮因子的生成等細胞功能至關重要。Fu等(2012)克隆表達Hps5型中6-DPG，通過Westernblotting方法證明6-DPG蛋白存在于細胞膜上，并發(fā)現(xiàn)其可以使Hps對豬肺泡上皮細胞(SJPLC)黏附率降低到69.5%，重組6-DPG蛋白可以誘導SJPLC產(chǎn)生炎癥刺激因子IL-6和IL-8，但與活菌和熱滅活菌相比要弱得多。對6周齡BALB/C小鼠免疫用重組6-DPG蛋白和弗氏完全佐劑制成的疫苗，2周后加強免疫1次，再腹腔注射5倍LD50(5.7×108)劑量的Hps攻毒，與陰性對照相比其保護率可達到75%。由此可知6-DPG也可以作為Hps抗菌劑或疫苗的備選抗原。

6 毒素

（1）毒素包括內毒素和外毒素，也是細菌毒力的重要組成部分。Amano(1997)等曾對脂多糖的致病作用進行了研究，利用血清5型菌株接種動物后發(fā)現(xiàn)，血液中LPS抗體的出現(xiàn)與血栓形成、彌漫性血管內凝血有關。業(yè)已清楚，副豬嗜血桿菌的脂多糖具有與其他革蘭氏陰性細菌內毒素相似的活性。因此，脂多糖也可能是副豬嗜血桿菌的一個重要的毒力因子。但是Zucker等(1996)并未發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌強毒株的脂多糖與無毒株的脂多糖有何明顯差異。同樣，Miniats等(1991)發(fā)現(xiàn)，用含有脂多糖和外膜蛋白抗原的細菌免疫動物，有外膜蛋白抗體的豬能抵抗強毒菌的攻擊。這些事實似乎表明，LPS不是副豬嗜血桿菌的主要毒力因子。（2）細胞膨脹毒素(CDT)是由CdtA、CdtB和CdtC3個亞基組成的不耐熱細胞毒素蛋白，能夠阻斷彎曲桿菌、杜克雷嗜血桿菌、放線桿菌和致病性大腸桿菌等的細胞周期，誘導細胞膨脹、細胞核擴大并最終凋亡，對于彎曲桿菌和放線桿菌它也參與對宿主細胞的黏附與入侵。CdtB部分氨基酸序列與DNAaseI家族相似，且純化的CdtB能夠表現(xiàn)DNA酶活性，當其在CdtA和CdtC協(xié)同進入宿主細胞后，CdtB就會進入細胞核引起DNA損傷。Zang等(2012)通過構建HpsSC096株的CdtA、CdtB、CdtA和CdtB缺失菌株，發(fā)現(xiàn)缺失后細菌對補體介導的血清殺菌作用更敏感，同時對豬臍靜脈血管內皮細胞和豬腎上皮細胞的黏附能力下降。Hps5型存在高度相似的2段編碼CDT蛋白基因，通過位點特異迭代BLAAST發(fā)現(xiàn)與哺乳動物的DNAaseI序列相比，Hps的CdtB基因有較遠親緣關系，說明CdtB在功能上保守。通過流式細胞術分別對3種CDT蛋白及其組合對細胞分裂的影響進行分析，發(fā)現(xiàn)當3種蛋白同時存在時能夠最大程度阻斷細胞分裂并使其停滯在G2期，而單獨的CdtA或CdtC或兩者混合物卻不能阻斷細胞分裂，這與其他菌科細菌CDT作用一致。超螺旋質粒鑒定His-Tag-CdtB證明其有DNA酶活性，而其余5種敲除了酶活性中心的CdtB突變蛋白則丟失了DNA酶活性。同時發(fā)現(xiàn)CdtC具有一段膽固醇識別氨基酸(CRAC)序列，缺失這一序列后其對細胞毒性降低，說明發(fā)揮細胞毒性作用依賴于膽固醇的存在。對所有15個血清型Hps和109株臨床分離株進行Westernblotting分析結果發(fā)現(xiàn)所有菌株都表達CDT并能夠發(fā)揮細胞毒性，這說明在Hps中CDT可能是一個保守的毒力因子(Mao和DiRienzo，2002)。

7 小結

綜上所述，副豬嗜血桿菌病對養(yǎng)豬業(yè)的危害正日益加重，但是在副豬嗜血桿菌毒力方面尤其是毒力因子和毒力基因在致病過程中的作用仍存在很多爭議，這是副豬嗜血桿菌致病機理研究的難點之一，也是能否有效防控該病的關鍵所在。近年來，近年來，隨著分子生物學、細胞生物學、生物化學、結構生物學和組織病理學等技術的深度融合，對Hps的部分毒力因子已有了比較深入了解，并且一些新的毒力因子不斷被發(fā)現(xiàn)。Hps的致病性是多種毒力因子共同作用的結果，各毒力因子的作用機理以及它們之間的相互作用與關系尚不是十分清楚，今后可從分子角度進一步明確各毒力因子基因表達和調控與致病性的關系，研究強毒力菌株與弱毒力菌株之間的分子差異，探索Hps致病過程中新的毒力因子以及各毒力因子之間相互作用的關系，以期為今后副豬嗜血桿菌致病性研究提供有效借鑒。

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