舒聯(lián)方,辛 虎，馬 均

(1.四川省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，四川 成都 610081；2.四川省林業(yè)物資供銷總公司，四川 成都 610081；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué),四川 溫江區(qū) 611130)

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紅豆杉提取紫杉醇利用技術(shù)進(jìn)展

舒聯(lián)方1,辛 虎2，馬 均3

(1.四川省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，四川 成都 610081；2.四川省林業(yè)物資供銷總公司，四川 成都 610081；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué),四川 溫江區(qū) 611130)

本文概述了紅豆杉屬植物繁殖及其替代途徑生產(chǎn)紫杉醇的主要技術(shù)方法以及這些技術(shù)方法的研究進(jìn)展、技術(shù)特點(diǎn)及存在問(wèn)題。重點(diǎn)論述了組織培養(yǎng)育苗和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇途徑及其技術(shù)關(guān)鍵。為今后相關(guān)工作提供借鑒與幫助。

紅豆杉;紫杉醇;技術(shù)進(jìn)展

紫杉醇(Taxol)是從紅豆杉(Taxuschinensis)樹(shù)皮中提取的一種天然二萜類抗癌活性物質(zhì)，對(duì)多種癌癥均有明顯療效[1]。近來(lái)還發(fā)現(xiàn)紫杉醇對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病都有一定的療效[2]。隨著紫杉醇藥理學(xué)研究的深入，其臨床應(yīng)用范圍將會(huì)不斷擴(kuò)大[3]。但到目前為止發(fā)現(xiàn)紫杉醇只存在于紅豆杉科的紅豆杉屬和澳洲紅豆杉屬中。而紅豆杉原植物中的紫杉醇含量為干質(zhì)量的0.005%～0.07%，不同種間和不同器官存在較大差異[4]。又由于紅豆杉類植物屬珍稀樹(shù)種，生長(zhǎng)也十分緩慢。因而造成紫杉醇生產(chǎn)原料供應(yīng)匱乏，需要尋找新的植物資源和新技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇。近年來(lái)，利用紅豆杉的新手段和生產(chǎn)紫杉醇的新技術(shù)成為了人們的研究熱點(diǎn)。本文綜述了有關(guān)技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 紅豆杉生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性

紅豆杉是紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)植物的總稱。在中國(guó)民間一般稱“紫杉”。全世界有11種，分布于北半球溫帶到熱帶地區(qū)。為典型的陰性樹(shù)種。常處于林冠下喬木第二、三層，散生，基本無(wú)純林存在，也極少有團(tuán)塊分布。對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格，生長(zhǎng)緩慢。且苗期過(guò)濕易染立枯病，喜陰、忌曬。

中國(guó)有4種1變種：東北紅豆杉(T.cuspidatasieb,et Zucc)云南紅豆杉(T.yunnanensisChang et L.K.Fu.)西藏紅豆杉(T.wallichianaZucc.)中國(guó)紅豆杉(T.chinensis(Pilger) Rehd.)南方紅豆杉(T.chinensisvar.mairei(Lenee et levl.)Chang et L,K.Fu.)

2 紅豆杉育苗繁殖生產(chǎn)紫杉醇

通過(guò)人工育苗和栽植以擴(kuò)大紅豆杉資源來(lái)供應(yīng)紫杉醇生產(chǎn)的原材料。這種方法不僅繁殖周期長(zhǎng)，且原植物體紫杉醇含量低，但它可以在滿足紫杉醇生產(chǎn)的同時(shí)又保持了紅豆杉的種質(zhì)資源。通過(guò)先進(jìn)的育苗技術(shù)快速繁殖紅豆杉,營(yíng)建藥用原料林是保護(hù)紅豆杉資源、滿足紫杉醇生產(chǎn)的有效途徑。

2.1 種子繁殖

紅豆杉為雌雄異株、異花受粉植物，種子產(chǎn)生數(shù)量少，且有動(dòng)物取食，使種子殘存量更少。而且種子種皮厚，處于深休眠狀態(tài)。自然狀態(tài)下經(jīng)兩冬一夏才能萌發(fā)。而且即使萌發(fā)，形成的幼苗抗逆性差，成活率也很低。所以，幾乎沒(méi)有天然的紅豆杉純林存在[5]。即使經(jīng)過(guò)人工催芽處理當(dāng)年采收播種也要第3年才陸續(xù)萌發(fā)[6]，不能滿足商業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化的需求。

2.2 扦插繁殖

紅豆杉扦插繁殖率和繁殖速度都比種子繁殖高。扦插繁殖所需插條長(zhǎng)約10 cm左右，當(dāng)年生枝、1 a～2 a生枝都能得到較高的扦插成活率，所以插條來(lái)源充足，繁殖率高。作者利用曼地亞紅豆杉5 a生扦插母樹(shù)1 a可采插條約10根，插穗長(zhǎng)約5 cm便可獲得95%以上的成活率。有報(bào)道東北紅豆杉扦插成活率可達(dá)95%，中國(guó)紅豆杉可達(dá)86%，云南紅豆杉可達(dá)90%，南方紅豆杉可達(dá)97%[7]。且在一定的設(shè)施下可全年進(jìn)行。扦插繁殖還可縮短育苗時(shí)間，一般扦插后6個(gè)月可獲得有完整根系的移栽苗。經(jīng)過(guò)近多年的發(fā)展，多處大規(guī)模的紅豆杉扦插基地己經(jīng)建立。

2.3 組織培養(yǎng)快速繁殖

組織培養(yǎng)快速繁殖是指利用植物的器官、組織或細(xì)胞在無(wú)菌的條件下再生出完整植株的方法。組織培養(yǎng)育苗和常規(guī)傳統(tǒng)育苗方法相比，有著巨大的優(yōu)越性。它繁殖率高、繁殖速度快，不受時(shí)間和季節(jié)的限制可全年進(jìn)行，繁殖出的無(wú)性系能保持母本的優(yōu)良性狀。利用組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)紅豆杉的快速繁殖主要有以下4種方法：離體胚培養(yǎng)法、嫩芽增殖法、愈傷組織再生植株法、體細(xì)胞胚發(fā)生法。紅豆杉種子去掉假種皮后，用自來(lái)水沖洗7次后進(jìn)行接種，萌發(fā)率可達(dá)100%，且均可完全成苗[8]。陳永勤用紅豆杉成熟胚在自己設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基上，97%以上可萌動(dòng)，80%以上的萌動(dòng)胚成苗[9]。離體胚培養(yǎng)法克服了紅豆杉種子難以萌發(fā)的缺點(diǎn)，可提高萌發(fā)率，縮短萌芽時(shí)間。但種胚來(lái)源有限，且得到的苗木為有性繁殖苗，不能保證保持母本的優(yōu)良性狀。嫩芽增殖法的關(guān)鍵是獲得大量的不定芽以實(shí)現(xiàn)快速增殖。而不定芽和不定根的產(chǎn)生主要取決于培養(yǎng)基的激素水平和母樹(shù)的樹(shù)齡。作者通過(guò)選擇腋芽增殖啟動(dòng)培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)各階段的最優(yōu)培養(yǎng)基和培養(yǎng)技術(shù)，可獲得完整的曼地亞紅豆杉試管苗。1月～3月是曼地亞紅豆杉腋芽增殖啟動(dòng)培養(yǎng)最適的取材時(shí)間；樹(shù)體上部枝條是啟動(dòng)培養(yǎng)的適宜外植體；升汞連續(xù)兩次消毒(6+6)min是曼地亞紅豆杉外植體消毒的適宜時(shí)間。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不同濃度及其組合對(duì)芽的啟動(dòng)有極顯著影響；MS+6-BA0.05mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1是曼地亞紅豆杉腋芽增殖啟動(dòng)培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。MS(有機(jī)物加倍)培養(yǎng)基是曼地亞紅豆杉腋芽增殖壯苗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基，有效芽率為72.73%，平均芽長(zhǎng)3.3 cm。將己經(jīng)生根的小苗轉(zhuǎn)移到不含激素的WPM培養(yǎng)基上30 d后，平均根數(shù)可達(dá)5.5條，平均根長(zhǎng)達(dá)1.6 cm，最長(zhǎng)根長(zhǎng)5.2 cm。培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500 1x，培養(yǎng)溫度25±1℃。用IBA1 000 mg·L-1作生根促進(jìn)劑處理30s瓶外生根，生根率最高，達(dá)到58.33%。是進(jìn)行曼地亞紅豆杉組培無(wú)根苗生根誘導(dǎo)的適宜處理方式。利用紅豆杉組織培養(yǎng)技術(shù),在人工環(huán)境中對(duì)紅豆杉組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),篩選高產(chǎn)紫杉醇細(xì)胞系,可以實(shí)現(xiàn)大量、連續(xù)地生產(chǎn)目的產(chǎn)物紫杉醇[10]。國(guó)內(nèi)外都己有了紅豆杉體細(xì)胞胚發(fā)生的專利和報(bào)道，證明紅豆杉體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)是可行的。由于紅豆杉屬植物本身的特性和組織培養(yǎng)方法沒(méi)有較強(qiáng)的可普遍運(yùn)用的規(guī)律的特殊性，近期要達(dá)到快速繁殖以及工廠化育苗還不容易，有待于進(jìn)一步深入研究。但應(yīng)用細(xì)胞工程技術(shù)，選育高產(chǎn)細(xì)胞系，誘導(dǎo)成苗，進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化栽培，可克服大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)容易染菌和對(duì)生物反應(yīng)器要求苛刻的弱點(diǎn)，以滿足對(duì)紫杉醇的需求，所以利用組織培養(yǎng)快速繁殖紅豆杉仍然是大有希望的。

3 細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇

自1983年紫草寧及其衍生物成為細(xì)胞培養(yǎng)的第一個(gè)商品以來(lái)，植物細(xì)胞培養(yǎng)(PTC)技術(shù)便成為工廠化生產(chǎn)有用次生代謝物的一個(gè)重要手段[11]。我國(guó)的紅豆杉屬4種1變種都含有紫杉醇及其類似物，并都己建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)。與愈傷組織相比，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)周期短，細(xì)胞生物量增加快，細(xì)胞培養(yǎng)與原植物相比，紫杉醇含量要高。反應(yīng)器中細(xì)胞中紫杉醇的產(chǎn)量可達(dá)0.1 mg·g-1細(xì)胞干重，為一般紅豆杉樹(shù)皮中的10倍，總紫杉醇的產(chǎn)量也較高[12]。這也是人們選擇此種方式來(lái)生產(chǎn)次生代謝物的主要原因。

3.1 紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的主要技術(shù)環(huán)節(jié)

利用紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇主要包括以下幾個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)：愈傷組織誘導(dǎo)——繼代培養(yǎng)——懸浮細(xì)胞培養(yǎng)——擴(kuò)大培養(yǎng)——分離、鑒定。

愈傷組織的誘導(dǎo)的研究前面己作介紹，不再累述。一般認(rèn)為疏松的愈傷組織更有利于細(xì)胞分散進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)可以縮短愈傷組織的生長(zhǎng)周期，提高愈傷組織的生長(zhǎng)量，而且通過(guò)多次繼代能夠減輕褐化，更有利于懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇。愈傷組織的培養(yǎng)及維持其正常生長(zhǎng)，多數(shù)用的是基本的或改良的B5培養(yǎng)基。用于愈傷組織誘導(dǎo)及繼代的基本培養(yǎng)基亦適用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。如MS、B5、WHITE等。激素與愈傷組織繼代培養(yǎng)的激素組合相同，適當(dāng)提高NAA的濃度更有利于生長(zhǎng)。懸浮培養(yǎng)時(shí)采用較短的繼代周期，可使細(xì)胞始終保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，保持旺盛生長(zhǎng)，延遲進(jìn)入穩(wěn)定期、死亡期[13]。懸浮培養(yǎng)中，接種量的大小往往對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響較大，須達(dá)到一定的起始濃度，但細(xì)胞過(guò)多又需消耗大量的養(yǎng)分。張立瑩等認(rèn)為采用2.0 g鮮重·瓶-1較為適宜[14]。日前使用的生物反應(yīng)器一般為10 L或20 L，且多數(shù)報(bào)道認(rèn)為在反應(yīng)器中細(xì)胞生長(zhǎng)速度和紫杉醇含量都較懸浮培養(yǎng)時(shí)低。這可能是由于受到生物反應(yīng)器的剪切力、通氣水平、氣體成分的影響[15，16]。

3.2 提高細(xì)胞培養(yǎng)紫杉醇產(chǎn)量的方法

3.2.1 高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選

在紅豆杉屬的11個(gè)種中發(fā)現(xiàn)有紫杉醇及其衍生物的存在,但不同種之間，紫杉醇及其衍生物含量有顯著差異；同一種內(nèi)不同個(gè)體之間的差異更大；同一樹(shù)種不同產(chǎn)地之間紫杉醇及其衍生物也存在顯著差異[12]。而且在離體培養(yǎng)條件下植物體細(xì)胞較易發(fā)生變異是個(gè)普遍現(xiàn)象，這又為選擇變異體創(chuàng)造了條件。因此，就有可能篩選出生長(zhǎng)又快又能高產(chǎn)的細(xì)胞系。石夢(mèng)蝶從自然界收集南方紅豆杉的細(xì)胞系,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)室建立的細(xì)胞培養(yǎng)體系和高效液相色譜檢測(cè)方法對(duì)獲得的細(xì)胞系材料進(jìn)行篩選,獲得了4個(gè)紫杉醇含量高于15 mg·L-1的細(xì)胞系：A26、B8、B35和B85[17]。

3．2．2 誘導(dǎo)子的加入

紫杉醇是紅豆杉屬植物產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物，生物或非生物誘導(dǎo)子可誘導(dǎo)紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)生抗逆反應(yīng)，啟動(dòng)次生代謝途徑，從而導(dǎo)致紫杉醇的大量合成。誘導(dǎo)子可分為內(nèi)源誘導(dǎo)子、外源誘導(dǎo)子或生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子[18]。在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常采用的誘導(dǎo)子主要有：硫酸銅、茉莉酸甲酯、水楊酸、苯丙氨酸、赤霉素及其它。誘導(dǎo)物濃度越高,促進(jìn)紫杉醇含量增高的作用越強(qiáng)，但誘導(dǎo)物濃度超過(guò)最適點(diǎn)后，隨著誘導(dǎo)子濃度提高，各處理的愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)不同程度地受限制。當(dāng)硫酸銅濃度為0.10 mg·L-1時(shí)，紫杉醇含量最高達(dá)到0.057%；當(dāng)水楊酸濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，紫杉醇含量最高達(dá)到0.072%；當(dāng)茉莉酸甲酯濃度為100 μmol·L-1時(shí)，紫杉醇含量最高達(dá)到0.087%[19]。

3.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中紫杉醇的原位提取

由于紫杉醇是一種細(xì)胞毒素，其在細(xì)胞內(nèi)的大量積累勢(shì)必影響細(xì)胞本身的生理代謝，從而影響次生代謝物的產(chǎn)生。必須要在不降低細(xì)胞活性及紫杉醇合成能力的情況下促使紫杉醇向細(xì)胞外分泌，減少其對(duì)細(xì)胞的毒害，有利于提高紫杉醇的產(chǎn)量。要實(shí)現(xiàn)紫杉醇的胞外釋放，常加入促釋放劑。如加入DMSO、甘露醇等。采用兩液相培養(yǎng)，用有機(jī)溶劑對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行原位提取也是提高培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的一條有效途徑，它能使胞外紫杉醇產(chǎn)量提高了10倍。但它也存在著有機(jī)相對(duì)細(xì)胞的毒性，有機(jī)溶劑對(duì)部分細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的培養(yǎng)基成分的溶解的問(wèn)題[20]。

4 紅豆杉替代資源途徑

4．1 產(chǎn)生紫杉醇真菌的發(fā)酵培養(yǎng)

微生物發(fā)酵途徑是一條最具潛力的途徑。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),從植物內(nèi)生真菌中發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇被證明是有效途徑之一。已發(fā)現(xiàn)多種可利用的內(nèi)寄生真菌能產(chǎn)生紫杉醇，比如：從短葉紅豆杉，西藏紅豆杉中分離出的內(nèi)生真菌。從紫杉醇的含量來(lái)看，從真菌培養(yǎng)液中僅獲得納克級(jí)的紫杉醇[ 21]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和微生物發(fā)酵工程的發(fā)展,工業(yè)上大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇將有望實(shí)現(xiàn)[ 22]。

4.2 遺傳轉(zhuǎn)化

利用根癌農(nóng)桿菌(Ri質(zhì)粒)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Ti質(zhì)粒)的不同野生型株系，以葉片、莖段、塊莖和培養(yǎng)材料等為受體均可成功的將外源DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入紅豆杉基因組中，引起植物產(chǎn)生冠癭瘤或瘤性“毛狀根”。這種瘤性組織生長(zhǎng)速度大大超過(guò)正常植物及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，產(chǎn)物產(chǎn)量高且穩(wěn)定，而且在培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)需添加外源性激素[23]。有報(bào)道用發(fā)根農(nóng)桿菌感染短葉紅豆杉芽外植體，誘導(dǎo)毛狀根[24]。但農(nóng)桿菌的寄主范圍主要是被子植物的雙子葉植物和少數(shù)的單子葉植物，而紅豆杉是裸子植物，而且由于T-DNA可以在植物染色體的任何部位插入，有可能導(dǎo)致與紫杉醇全成有關(guān)的基因失活。所以對(duì)于高產(chǎn)紫杉醇的細(xì)胞系的篩選是非常重要的。

冠癭組織或毛狀根培養(yǎng)雖然有許多不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，但其代謝產(chǎn)物中同時(shí)產(chǎn)生胭脂堿及冠癭堿，這種物質(zhì)對(duì)于人及哺乳動(dòng)物具有致命的毒害，而提純以去掉冠癭堿的過(guò)程花費(fèi)很大，阻礙了冠癭組織或毛狀根培養(yǎng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。

4.3 化學(xué)合成

化學(xué)合成方法由于其反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)用較高，難以形成商業(yè)化生產(chǎn)。半合成主要是依賴自然資源提取獲得的紫杉醇前體baccatinIII,10-DAC-baccatinIII等，也要以犧牲自然資源為代價(jià)，不能從根本上解決紫杉醇來(lái)源問(wèn)題。

5 利用的前景展望

目前，南方紅豆杉繁殖技術(shù)的研究已取得了可喜的成就，尤其在實(shí)生苗繁殖和扦插苗繁殖方面，已可用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。為了更好的發(fā)展南方紅豆杉產(chǎn)業(yè)，今后應(yīng)加大力度研究南方紅豆杉的組培育苗技術(shù)及加強(qiáng)其優(yōu)良品種的篩選和培育。選取紫杉醇含量高，生長(zhǎng)快，易成活，抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良品種進(jìn)行培育可更有效的擴(kuò)大南方紅豆杉的資源，滿足市場(chǎng)需求。

紫杉醇由于其巨大的醫(yī)藥和商業(yè)價(jià)值，目前己成為許多科研機(jī)構(gòu)和科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。但由于紅豆杉自身的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性和紫杉醇的特殊化學(xué)特性，紫杉醇的各種生產(chǎn)手段都還未取得實(shí)質(zhì)性的突破。但我們應(yīng)當(dāng)看到，這些生產(chǎn)手段都具有著巨大的生產(chǎn)潛力，隨著研究的不斷深入，實(shí)現(xiàn)紫杉醇的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)是大有希望的。

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Advances in Technology of Extracting Taxol fromTaxuschinensis

SHU Lian-fang1XIN Hu2MA Jun3

(1.Sichuan Forest Inventory and Plan institute,Chengdu 610081,China;2.Sichuan Forestry Material Supply and Marketing General Corporation,Chengdu 610081,China;2.Sichuan Agricultre University,Wenjiang 611130,China)

In this paper,a summary description is given of the technology of producing taxol fromTaxuschinensis,its research advances，the main technical features and existent problems.Emphasis is put on dealing with the technology of tissue culture and cell culture for production of taxol.

Taxuschinensis,Taxol,Technical progressing

2017-02-10

舒聯(lián)方(1974-)，男，高級(jí)工程師，碩士，主要從事林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)工作。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.02.010

S723.1

A

1003-5508(2017)03-0052-04