張守都, 李 娟, 叢文虎, 李 莉

(1. 青島國家海洋科學研究中心, 山東 青島 266072; 2. 國家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測中心, 山東 青島 266011;3. 威海海洋職業(yè)學院, 山東 威海 264300; 4. 中國科學院海洋研究所, 山東 青島 266071)

在回交后代中選擇具備優(yōu)良目標性狀的個體進行連續(xù)回交是回交育種最常用的方法。因此, 對優(yōu)良個體的選擇關系到目標性狀能否被有效導入輪回親本, 關系到回交育種計劃的成功與否。為了更快地恢復輪回親本的優(yōu)良生產性狀, 應該從回交后代, 尤其是在早代中選擇具有優(yōu)良目標性狀而大部分其他生產性狀又與輪回親本盡可能相似的個體進行回交。為了易于鑒別和選擇具有優(yōu)良目標性狀的個體,需要創(chuàng)造使該性狀得以充分顯現的條件。例如, 探索并創(chuàng)造適合回交個體的最佳環(huán)境條件, 并且清楚環(huán)境條件中最主要因素對不同基因型個體所產生的影響以及這些因素之間的交互作用。

科學家很早就發(fā)現基因型與環(huán)境之間能夠產生互作[1]。在不同環(huán)境中不同基因型群體在存活和/或生長的差別可能會有所改變[2-11]。對海洋生物而言, 溫度和鹽度是兩個最重要和最基本的環(huán)境因素和環(huán)境脅迫的來源, 并且它們的生物學效應常常以某種方式相互聯(lián)系[12]。1982年, 海灣扇貝的北方亞種 Argopecten irradians irradians(Lamarck)首先從美國引入中國[13]。1998年和1999年, 該亞種新的野生群體再次被引進到中國[14], 現已成為我國北方海區(qū)的海灣扇貝主要養(yǎng)殖群體。以該養(yǎng)殖群體為材料, 經過多代的定向選育, 扇貝育種工作者成功地培育出了“中科紅”和“中科 2號”兩個海灣扇貝新品種。南方亞種Argopecten irradians concentricus(Say)在1991年也被成功地引進到中國[15],目前主要養(yǎng)殖區(qū)域集中在我國的北部灣海區(qū)。由于這兩個亞種對環(huán)境適應能力尤其是對溫度的適應能力差別迥異, 兩個亞種在我國的養(yǎng)殖也受限于品種和地理分布, 產業(yè)發(fā)展不均衡。兩個亞種在跨亞種雜交時能夠產生顯著的雜種優(yōu)勢[16], 因此, 通過開展連續(xù)回交育種并且培育適應新環(huán)境的新品種具有積極的研究價值和商業(yè)前景。本研究在南北亞種雜交的基礎上, 構建了正反向回交群體、雜交F2群體和北方對照群體, 然后把各個群體幼蟲在不同的溫度、鹽度環(huán)境中培養(yǎng), 研究不同基因型群體在不同環(huán)境下幼蟲生長、存活以及各因子之間的互作效應, 為海灣扇貝回交選擇育種應用和推廣提供理論依據和實踐基礎。

1　材料與方法

1.1　親貝的獲取與培養(yǎng)

海灣扇貝南北亞種雜交貝(Z) 為2011年春季由

[Foundation: Modern Agro-industry Technology Research System (CARS-47);Chinese National Natural Science Foundation (31502150)]

1.2　實驗設計與采卵

從每個群體中為每個實驗重復各隨機選擇20個性腺發(fā)育至第IV期的個體[18]。參照鄭懷平等[17]的組合方法來實現雌雄同體的扇貝相繼分開排放精卵。

首先, 將所有待產扇貝放在空氣中陰干大約30 min。接下來給每個扇貝個體的閉殼肌注射 0.1 mL的0.02 mmol/L 的五羥色胺[19]。最后是升溫刺激, 將每個扇貝放在一個單獨的 1 L的燒杯中, 燒杯中注入23℃的沙濾海水。大約20~40 min后, 扇貝開始排放精子, 這個過程大約持續(xù)30 min。接下來會有一個大約10 min的暫停期, 這時候將扇貝取出來用干凈海水反復沖洗, 將燒杯中水倒掉經淡水消毒后重新注入同溫海水, 將扇貝再放回燒杯繼續(xù)產卵。該過程重復數次, 直到扇貝開始排放卵子。接下來收集卵子并經直徑 30 μm的篩絹進行洗卵, 以盡可能降低自交發(fā)生概率。將收集到的卵子在顯微鏡下鏡檢, 如果發(fā)現卵子已經受精則視為被污染, 則丟棄之。最后在每個實驗重復中每種扇貝收集10份純凈未受精的卵子備用。

將所有的扇貝卵子平均分成2份, 其中1份用另外一種10只扇貝的混合精子受精, 另外一份用自己種內的另外 9只扇貝的混合精子受精。將具有相同交配類型的受精卵混合, 至此通過種間的雙列雜交產生了 4個不同的遺傳組別, 分別以精子來源在前命名為: ZZ(雜交F2組) 和NN (對照組組), ZN和NZ(正反回交組)。

1.3　幼蟲孵化與培育

每組受精卵用50 L的塑料桶養(yǎng)在22℃和鹽度為30的沙濾海水中, 孵化密度為 20 個/mL。每 0.5 h攪桶一次來提高孵化率, 大約24 h受精卵孵化至D形幼蟲。

待完成幼蟲孵化后, 4個實驗組幼蟲都分別受到了18、23、28℃三個溫度水平和25、30、35三個鹽度水平的處理。溫度 23℃是扇貝育苗的正常培育水溫, 鹽度 30是實驗點自然海水的鹽度, 因此, 溫度23℃和鹽度30被視為其他實驗組的對照。實驗使用的容器是250 mL的玻璃燒杯, 水體是200 mL, 幼蟲起始密度是10個/mL, 每天投餌2次、全換水1次,新配制的海水在換水前被預熱或預冷, 換水時燒杯都被徹底地清洗, 整個實驗過程不充氣。投喂餌料為新鮮金藻 Isochrysis galbana, 隨幼蟲生長投喂量細胞數從2 000個/d提至10 000個/d。所有的換水設備在一組用過之后浸泡在淡水中5 min, 將沾染幼蟲殺死, 避免各遺傳組別間交叉污染。

1.4　取樣與數據測量

幼蟲的生長是通過測量各組的1日齡和10日齡的幼蟲殼長計算, 存活率通過1日齡和10日齡的密度變化來計算。

1.5　數據分析

不同交配組合間的生長和存活, 采用單因素方差分析, 并進行多重比較。將殼長和殼高數據轉換成對數以增加正態(tài)性與方差齊性[20], 存活率轉換成三角函數[21]。

普通線性模型被用來分析基因型G(ZZ, ZN, NZ,NN)與環(huán)境 E(溫度: 18、23、28℃或鹽度: 25、30、35)對各性狀單獨影響和交互影響, 該模型如下:

Yijk= μ + Gi+ Ej+ (G× E)ij+ eijk

模型中, Yijk是來自第i個交配方式的第j種環(huán)境處理的第k個個體的性狀表型值; μ是常數項; Gi是基因型的影響(i = 1、2、3、4); Ej是環(huán)境的影響(j = 1、2、3);(G×E)ij是基因型和環(huán)境的交互影響; eijk是隨機觀察誤差。

生長優(yōu)勢 (A) 按以下公式計算[19]:

A(%)=[(F1－P)×100] / p

其中, F1為回交組合或雜交二代的平均殼長或存活率; p為對照群體的平均殼長或存活率。所有的統(tǒng)計分析均采用 SPSS 19.0, 差異顯著性設為P < 0.05。

2　結果與分析

2.1　溫度與基因型之間的互作

2.1.1溫度對4種基因型幼蟲存活率的影響

圖1反映出溫度對4種基因型幼蟲的存活率都能夠產生顯著的影響, 但不同溫度影響結果并不相同。低溫時(18℃), 雜交F2組ZZ的存活率高于對照組NN的存活率, 但差異不顯著, 回交組ZN的存活率顯著高于NZ組的存活率; 高溫時(28℃), 雜交F2組ZZ的存活率依舊高于對照組NN的存活率, 但差異不顯著, 而回交組NZ的存活率略高于ZN組的存活率; 23℃時, 雜交 F2組 ZZ的存活率低于對照組NN的存活率, 同樣差異并不顯著, 回交組 NZ的存活率要顯著高于其他組的存活率。

圖1　溫度對海灣扇貝不同基因型幼蟲存活率的影響(各溫度中字母相同表示差異不顯著(P > 0.05))Fig. 1 Influence of temperature on larval survival of four experimental groups (Within the same temperature,means with the same letter are not signif i cantly different (P > 0.05))

方差分析(表 1)表明, 雖然基因型并未對存活產生顯著影響, 但溫度都能夠對存活率產生顯著的影響(P<0.001), 而它們的交互作用也是顯著的(P<0.01)。

表1　不同基因型幼蟲在不同溫度下幼蟲存活率的方差分析Tab. 1 Variance analysis for larval survival of the four groups at different temperature level

2.1.2不同溫度下回交組和雜交 F2組幼蟲存活率的生長優(yōu)勢

無論是回交組(NZ, ZN)還是雜交F2組(ZZ), 低溫組(18℃)和高溫組(28℃)的存活優(yōu)勢都明顯地高于對照組(23℃)的存活優(yōu)勢(表 2), 說明無論是回交組(NZ, ZN)還是雜交F2組(ZZ)均比對照組(NN)對低溫和高溫更具有存活耐受性。

2.1.3溫度對4種基因型幼蟲生長的影響

溫度對 4種基因型幼蟲的生長速度都能夠產生顯著的影響, 隨溫度的升高, 生長顯著地加快(圖2)。低溫時(18℃), 雜交F2組ZZ和回交組ZN比回交組NZ和對照組NN生長的要快, 回交組ZN生長速度顯著高于雜交F2組ZZ, 而雜交F2組ZZ與對照組NN生長速度差異并不顯著。在常溫時(23℃), 回交組(ZN、NZ)生長速度要略高于雜交F2組(ZZ)和對照組(NN), 但只在NZ和NN組間差異顯著。高溫時(27℃),兩個回交組(ZN、NZ)生長最快, 雜交F2組(ZZ)次之,而對照組(NN)則生長最慢。

表2　不同溫度各組幼蟲存活率的生長優(yōu)勢(A)Tab. 2 Survival advantage compared to purebred group(NN) at different temperature level

圖 2 溫度對海灣扇貝不同基因型幼蟲生長的影響(各溫度中字母相同表示差異不顯著(P > 0.05))Fig. 2 Influence of temperature on larval growth of four experimental groups(Within the same temperature,means with the same letter are not signif i cantly different (P > 0.05))

方差分析(表 3)表明, 溫度都能夠對存活率產生顯著的影響(P<0.001), 但基因型并未對存活產生顯著影響, 而它們的交互作用對生長影響也是顯著的(P<0.01)。

2.1.4不同溫度下回交組和雜交F2組10日齡幼蟲殼長的生長優(yōu)勢

無論是回交組(NZ, ZN)還是雜交F2組(ZZ), 低溫組(18℃)和高溫組(28℃)的生長優(yōu)勢都高于對照組(23℃)的殼長生長優(yōu)勢(表4), 說明無論是回交組(NZ,ZN)還是雜交 F2組(ZZ)均比對照組(NN)對低溫和高溫更具有耐受性。

表 3 不同基因型幼蟲在不同溫度下 10日齡殼長生長的方差分析Tab. 3 Variance analysis for larval 10th d shell length of the four groups at different temperature level

表4　不同溫度各組幼蟲殼長生長的生長優(yōu)勢(A)Tab. 4 Growth advantage compared to purebred group(NN) at different temperature level

2.2　鹽度與基因型間的互作

2.2.1鹽度對4種基因型幼蟲存活率的影響

4種基因型幼蟲在相同鹽度下的存活率并不相同(圖3)。其中, 2個鹽度組(鹽度25組和鹽度30組)結果比較接近, 回交組(ZN、NZ)組和雜交F2組的存活率都顯著高于 2個對照組(NN)。而高鹽度組(35)中對照組(NN)則表現出了最高的幼蟲存活率, 雜交F2組(ZZ)幼蟲存活率則最低, 但各實驗組別間差異都不顯著。

圖 3 鹽度對海灣扇貝不同基因型幼蟲存活率的影響(各鹽度中字母相同表示差異不顯著(P > 0.05))Fig. 3 Influence of salinity on larval survival of four experimental groups(Within the same salinity, means with the same letter are not signif i cantly different(P > 0.05))

方差分析(表 5)表明, 雖然基因型沒有對幼蟲存活率產生顯著影響(P>0.05), 鹽度都能夠對幼蟲存活率產生極顯著的影響(P < 0.001), 而它們的交互作用也是極顯著的(P < 0.001)。

表5　不同基因型幼蟲在不同鹽度下存活率的方差分析Tab. 5 Variance analysis for larval survival of the four groups at different salinity level

2.2.2不同鹽度下回交組和雜交 F2組幼蟲的存活優(yōu)勢

無論是回交組(NZ, ZN)還是雜交F2組(ZZ), 低鹽組(鹽度25)和高鹽組(鹽度35)的生長優(yōu)勢都明顯地低于對照組(鹽度 30)的生長優(yōu)勢(表 6), 而高鹽組中的回交組(NZ, ZN)或雜交 F2組(ZZ)相對于對照組的生長優(yōu)勢最低, 甚至為負值。結果說明無論是回交組(NZ, ZN)還是雜交 F2組(ZZ)相比對照組(NN)對低鹽和高鹽的耐受性上并無優(yōu)勢, 高鹽甚至為負值。

表6　不同鹽度各組幼蟲存活率的生長優(yōu)勢(A)Tab. 6 Survival advantage compared to purebred group(NN) at different salinity level

2.2.3鹽度對4種基因型幼蟲生長的影響

鹽度對 4種基因型幼蟲的生長速度都能夠產生顯著的影響, 隨鹽度的升高, 生長顯著地受到抑制(圖 4), 結果基本符合海灣扇貝最適合鹽度的生物學屬性。在低鹽(鹽度25)和中鹽(鹽度30)條件下, 雜交F2組 ZZ和回交組(ZN和 NZ)的都明顯地比對照組NN生長快, 而在高鹽時(鹽度35), 雜交F2組ZZ和回交組(ZN和NZ)生長均明顯地慢于對照組NN, 但實驗組別間差異不顯著。

方差分析(表 7)表明, 鹽度能夠對存活率產生顯著的影響(P<0.05), 但基因型并未對存活產生顯著影響(P>0.05), 而鹽度與基因型之間的交互作用對存活影響極顯著(P<0.01)。

圖4　鹽度對海灣扇貝不同基因型幼蟲生長的影響(各鹽度中字母相同表示差異不顯著(P > 0.05))Fig. 4 Influence of salinity on larval growth of four experimental groups (Within the same salinity, means with the same letter are not signif i cantly different (P > 0.05))

表 7 不同基因型幼蟲在不同鹽度下 10日齡殼長生長的方差分析Tab. 7 Variance analysis for larval 10d shellength of the four groups at different salinity level

2.2.4不同鹽度下回交組和雜交F2組10日齡幼蟲殼長的生長優(yōu)勢

無論是回交組(NZ, ZN)還是雜交 F2組(ZZ),低鹽組(鹽度 25)和高鹽組(鹽度 35)的殼長生長速度都低于對照組(鹽度 30)的生長速度(表 8), 而高鹽組(鹽度35)中的回交組(NZ, ZN)或雜交F2組(ZZ)相對于對照組的生長優(yōu)勢最低, 甚至為負值。結果說明無論是回交組(NZ, ZN)還是雜交F2組(ZZ)相比對照組(NN)對低鹽和高鹽的耐受性上并無優(yōu)勢,高鹽條件下回交組和雜交F2組甚至表現出負的生長優(yōu)勢。

表8　不同鹽度下各組幼蟲存活率的生長優(yōu)勢(A)Tab. 8 Growth advantage compared to purebred group at different salinity level

3　討論

生長速度與存活率(抗病力)是品種選育中最重要的生產性狀。同高等動物生長速度與肉質等性狀的表現的負相關[22-23]不同, 在許多水產動物研究中均發(fā)現生長速度和存活率存在明顯正相關, 周銀環(huán)等[24]發(fā)現等鞭金藻、亞心形扁藻和和小球藻對珠母貝幼蟲生長和存活也能產生一致的影響, 劉志剛等[25]在海灣扇貝南方亞種選育中發(fā)現選育家系的生長速度與存活率均高于對照家系?？捉艿萚26]通過對生長速率、存活的協(xié)同選擇, 培育出了“黃海2號”中國對蝦新品種。在本研究中各個實驗組別的生長速度和存活率基本保持正相關, 即生長速度快的組別存活率也相對較高。

品種選育的理想目標是實現優(yōu)良生產性狀在不同環(huán)境中保持穩(wěn)定狀態(tài), 即一個品種要具有能夠調節(jié)其表現的特性, 使之適應不同環(huán)境的變化, 維持其內在平衡的生理、生殖特性, 也要具有低的遺傳型與環(huán)境的交互作用, 通俗來講就是品種具有廣泛的環(huán)境適應性。目前, 水產動物研究工作者開展了貝類、海參等的環(huán)境與生長之間關系的研究, 劉超等[27]開展了不同鹽度對施氏獺蛤浮游期幼蟲存活與生長的影響的研究, 張媛等[28]開展了水溫、鹽度和餌料密度對橄欖蚶濾水率的影響研究, 侯西坦等[29]進行了刺參不同選育品系幼參對低鹽脅迫的耐受及生理生化影響的研究, 孔寧等[30]開展了水溫和鹽度對皺紋盤鮑“97”選群第 6代變態(tài)級變態(tài)幼蟲生長存活影響的研究, 研究初步闡釋了溫度、鹽度等環(huán)境因素對生長和存活的影響, 但較少涉及基因型和環(huán)境的互作的研究, 鄭懷平等[31]曾對海灣扇貝的環(huán)境與基因型互作進行過初步研究。

基因型和環(huán)境的互作是指: 生產性狀包括生長速度、存活率、產量、品質、抗逆等性狀的表現都是基因型和環(huán)境共同作用的結果, 基因通過控制一定的生理生化過程而實現其作用, 環(huán)境因素則通過各種作用機制影響著基因所控制的生理生化反應,從而影響基因的表達。在數量遺傳學中, 表型方差被剖分為基因型效應(G)、環(huán)境效應(E)和 GEI 三個部分, 而在這三部分中, 關于基因型效應的研究最為深入, 數量遺傳學將其進一步剖分為加性效應、顯性效應和上位性效應。在水產動物群體遺傳改良中, 亦參照植物和動物用隨機試驗設計被用來量化不同的基因效應, 不同方式的雙列雜交設計, NCⅠ、NCⅡ、NCⅢ 設計已經被廣泛應用。隨著基因作用效應理論研究的深入以及應用于水產動物育種實踐, 在增加產量、改善品質和提高品種抗逆性方面取得了較好的效果。但在品種選育過程中, 環(huán)境是一個重要的因素, 如何正面利用環(huán)境因素關系到選育計劃的效率甚至成敗。在多變環(huán)境品種試驗中, 不論是環(huán)境效應(E)還是基因型與環(huán)境的互作(genotype by environment interaction, GEI), 大多表現出E和GEI比基因型效應(G)要大。在一個成功的選擇育種計劃中, 新品種要在各種不同的生態(tài)環(huán)境內實現廣泛推廣, 新品種不僅在一個區(qū)域具有高產、優(yōu)質、抗逆能力強, 而且其他多種環(huán)境內也具有相同或相似的穩(wěn)定表現。作物品種產量、品質和抗性等性狀的表現型并非基因型效應與環(huán)境效應的簡單相加, 而是還有 GEI在起作用, 這一點早已被廣大遺傳育種學家和遺傳學家所認同。但是目前, 相對于基因型效應而言, 對水產動物的環(huán)境效應和 GEI的研究太少。實際上, 環(huán)境是一個具有時間和空間特性的極其復雜的多維實體,對基因型效應有重要影響, 理論上應受到研究者更多的關注。但在以往的選擇育種實踐和生產試驗中,環(huán)境因被過于簡化而其作用未受到足夠的重視。為加快選擇育種進程, 大多數品種試驗安排在條件最好的環(huán)境(試驗點), 并給予最好的生產管理, 從而保證有利基因的完全表達, 雖然這也符合“優(yōu)養(yǎng)”的養(yǎng)殖理念, 但在這些“最優(yōu)環(huán)境”中選育的基因型只能在少數有利環(huán)境中才能重復其表現, 而有時候環(huán)境多樣性及變化并不能以我們的意志為轉移。因而環(huán)境在新品種選育和作物生產中越來越受到育種學家和遺傳學家的重視。由于這種交互作用的存在, 減少了同一基因型在不同環(huán)境條件下一致的表現, 從而使得基因型與表現型的相關性降低, 在遺傳育種實驗中, 降低了從表現型試驗結果推斷基因型的可信程度。因此, 開展作物育種工作, 需要根據育種目標對 GEI 加以仔細分析和充分利用。如果要使所育成品種成為適應廣大地區(qū)環(huán)境的新品種, 那么育種方案應該選擇 GEI較小的品種。相反, 如果其目的是選育適應特殊地區(qū)環(huán)境的品種, 則育種方案可以選擇 GEI較大的品種。所以, 研究環(huán)境和基因型的互作對于水產動物新品種的選育目標和試驗評價是一個重要考慮因素和研究課題。

4　結論

本研究中選擇了最能夠影響海灣扇貝的兩個基本環(huán)境因素——溫度和鹽度, 作為研究環(huán)境與基因型互作的對象?；蛐汀h(huán)境互作分析對于扇貝新品種的鑒定, 新品種的推廣, 育種區(qū)域的劃分和育種目標的制定具有十分重要的意義。新品種不但需要具有優(yōu)良性狀的基因型, 還要能夠適應于不同的環(huán)境, 不但在適宜的環(huán)境條件下有良好的表現, 而且也要能夠適應不利的環(huán)境, 即降低環(huán)境與基因型互作在方差組分中的比例。依據本研究結果可以歸納出以下兩個重要的結論: 1)海灣扇貝亞種間雜交F2代和回交后代相對于純種對照組依舊存在生長優(yōu)勢, 這是繼續(xù)開展選擇育種的基礎; 2)雜交 F2代和回交后代相比純種對照組更能夠適應多變的溫度,而鹽度并非如此。在所有的溫度下, 雜交F2代和回交后代幼蟲始終比純種對照組幼蟲存活率高、生長快, 雜交背景依舊產生了積極的生長優(yōu)勢; 幼蟲存活率最高可以達到 15.02%, 幼蟲生長速度的優(yōu)勢最高可以達到19.96%。實驗對照組23℃水溫是海灣扇貝苗種培育所用的水溫, 對照組30鹽度是自然海水的鹽度。同對照組相比, 實驗中的低溫18℃和高溫28℃以及低鹽 25和高鹽 35對幼蟲來說均屬于不利的環(huán)境(逆境), 雜交 F2代和回交后代幼蟲在高溫、低溫等溫度逆境中表現出了更好的生長優(yōu)勢, 說明雜交F2代和回交后代幼蟲比北方純種對照組更能夠適應不利的溫度環(huán)境, 而在高鹽、低鹽等鹽度逆境中卻表現出了生長劣勢, 這種差異可能與海灣扇貝南北兩個亞種的適溫和適鹽范圍有關, 雜交F2代和回交后代兼具南北方兩個亞種的溫度適應特征, 因而具有更廣的適溫范圍, 在試驗設定的溫度條件下均能夠適應并表現出較大雜種優(yōu)勢, 而南北方亞種的鹽度適應特征并無太大差異, 實驗設置高鹽條件已經超出了 2個亞種的最適鹽度上限, 各個實驗組別的生長存活均受到較大抑制, 雜交與回交組別生長優(yōu)勢也不再體現, 具體原因尚需進一步研究。本研究結構表明海灣扇貝南北亞種間雜交并開展回交育種是海灣扇貝遺傳改良的一個重要的途徑, 為海灣扇貝繼續(xù)開展回交育種實踐和發(fā)展不同海區(qū)產業(yè)提供了有益的參考。

致謝: 感謝青島嶗東海珍品良種培育有限公司為本研究提供了實驗所用的場地以及所有設施。

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