唐曉桐 徐 建 許艷茹 于艷輝 石 菊 邢 成 鄭廣晶 崔憲利 白 冰
(吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司 長(zhǎng)春·130012)
精芪雙參膠囊由黃芪、丹參、人參、黃精四味藥組成,補(bǔ)氣養(yǎng)陰,活血化瘀,養(yǎng)心安神;適用于心腦血管疾病之心悸氣短,頭暈頭痛,倦怠乏力,耳鳴眼花等病癥。腦缺血再灌注損傷既包括急性細(xì)胞壞死也包括細(xì)胞凋亡。腦缺血再灌注后神經(jīng)損傷是一個(gè)復(fù)雜的超聯(lián)反應(yīng),項(xiàng)目:“雙十工程”重大科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(20150301009YY)。吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
其損傷機(jī)制主要是與細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基損傷、興奮性氨基酸增加、炎癥因子釋放及酶類等因素有關(guān)[1-2]的復(fù)雜的多因素過程。大量文獻(xiàn)報(bào)道黃精多糖、人參花蕾皂苷、人參Rb組皂苷和黃芪等成分都有保護(hù)腦損傷的作用[3-6]。
缺血性腦血管疾病的發(fā)病率、致殘率和病死率均較高,一般以局灶性腦缺血為主,其中大腦中動(dòng)脈栓塞造成的腦梗死最為多見,因此精芪雙參膠囊在腦缺血疾病的治療方面有廣闊前景。
1.1動(dòng)物ICR小鼠,雌雄各半,6-8周齡,體重18-22g;SD大鼠,雌雄各半,體重230-250g;均購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(吉 )-2014-0003。
1.2藥物與試劑精芪雙參膠囊:棕色粉末,由吉林長(zhǎng)白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供,批號(hào):20150829;鹽酸氟桂利嗪膠囊,西安楊森制藥有限公司,批號(hào):150327791;TTC:貨號(hào)T8170;甲醛,批號(hào):170305,天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;無水乙醇,批號(hào):20151215,北京化工廠;腫瘤壞死因子-α,批號(hào):20170208,南京建成生物工程研究所;白介素-1β:批號(hào):20170208,南京建成生物工程研究所。
1.3儀器MCAO線栓,型號(hào):2634-A4、2636-A4,北京西濃科技有限公司。酶標(biāo)儀SMP-500-18272-LSI0型:Manufactured in China Designed in California USA ;精密電子天平ESJ60-4:沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司;電熱恒溫水浴鍋:上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;離心機(jī)LDZ5-2型:北京醫(yī)用離心機(jī)廠。
2.1對(duì)小鼠腦缺血后存活時(shí)間的影響[7]
2.1.1分組及方法ICR小鼠50只,隨機(jī)分為空白組,鹽酸氟桂利嗪組(3mg·kg-1),精芪雙參高、中、低劑量組(1800、1080、360mg·kg-1),每組10只,灌胃給藥10ml·kg-1,連續(xù)7d。末次給藥后1h在小鼠耳后2mm處快速斷頭,使頭落到預(yù)熱至37℃的水浴箱上,然后記錄小鼠斷頭后的呼吸次數(shù)及呼吸維持時(shí)間(以小鼠張口喘息為判斷標(biāo)準(zhǔn))。
2.1.2檢測(cè)指標(biāo)腦組織含水量及腦指數(shù)測(cè)定:于冷凍冰袋上快速開顱取腦,以-4℃生理鹽水洗凈血漬用濾紙吸干,用眼科鑷子和手術(shù)刀片取下嗅球、小腦及低位腦干,留取大腦,將腦分別置于電子天平(萬分之一)稱濕重。然后將腦放于烘箱中恒溫100℃,24h持續(xù)烘干,然后稱大腦干重,計(jì)算腦含水量。(腦含水量=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%;腦指數(shù)=腦濕重/體重×100%)
2.2大鼠腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)[8-10]
2.2.1分組及方法 SD大鼠90只,隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型對(duì)照組,鹽酸氟桂利嗪組(2mg·kg-1),精 芪 雙 參 高、 中、 低 劑 量 組(1000、500、250mg·kg-1),每組15只,灌胃給藥10ml/kg,連續(xù)給藥7d,手術(shù)前12 h動(dòng)物術(shù)前禁食不禁水,于末次給藥后1h,用戊巴比妥鈉(45mg·kg-1)麻醉大鼠,將大鼠仰臥位固定,用碘伏潤(rùn)濕頸部毛,用手術(shù)剪刀將大鼠頸部正中切口約20-25mm,分離皮下結(jié)締組織。分開頸前肌群,剝離神經(jīng),暴露頸總動(dòng)脈,沿頸總動(dòng)脈向上剝離可見頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA),用手術(shù)線將ECA、ECA分支枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈和ECA的終末支遠(yuǎn)心端結(jié)扎,再在近心端并遠(yuǎn)離勁總動(dòng)脈的地方結(jié)扎,使頸外動(dòng)脈兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)之間有一定距離。CCA、ICA用動(dòng)脈夾夾閉,把ECA遠(yuǎn)心端拉直與ICA成一條直線,用眼科手術(shù)剪在ECA上剪一小口。將線栓彎曲向屋頂方向從ECA插入ICA,扎緊分叉處手術(shù)線,移去ICA上的動(dòng)脈夾,進(jìn)入ICA。缺血2h后,拔出線栓進(jìn)行再灌注。
2.2.2動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[11]腦缺血再灌注后將蘇醒后的動(dòng)物放回籠內(nèi),使其自由飲食。24h后按z-Longa評(píng)分法隨機(jī)評(píng)估并記錄神經(jīng)功能缺損評(píng)分:無功能障礙記為0分;不能伸展右側(cè)前肢記為1分;向右側(cè)旋轉(zhuǎn)記為2分;向右側(cè)傾倒記為3分;無自主活動(dòng)伴意識(shí)障礙記為4分;死亡記為5分。分?jǐn)?shù)越高,表示動(dòng)物神經(jīng)功能損傷越大。滿足1分、2分和3分的動(dòng)物為造模成功。
2.2.3檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血,2500r·min-1離心10min后分離血清,ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β。
2.2.4測(cè)定腦組織勻漿中SOD、MDA和LDH活性 冰盒上取腦組織,用眼科鑷子去除嗅球,用生理鹽水按腦組織:生理鹽水=1:9勻漿,制成10%勻漿液,3000r·min-1離心15min,按照試劑盒說明書,測(cè)定SOD、MDA和LDH活性。
2.2.5腦梗死面積 大鼠麻醉后斷頭取腦,冰生理鹽水預(yù)處理10min,自前向后切成5片,每片切成2mm厚。0.25%TTC溶液染色,37℃避光孵育30min(每隔10分鐘翻動(dòng)一次),染色完成后用10%甲醛溶液固定,數(shù)碼相機(jī)拍照,用圖片處理軟件計(jì)算腦梗死容積百分比(紅色為正常腦組織,白色為腦梗死組織)。
2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
3.1 對(duì)小鼠腦缺血后存活時(shí)間的影響
陽性對(duì)照組可以明顯延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間及斷頭后的喘息次數(shù),并能降低腦指數(shù)及腦含水量的增加,與空白組比較有顯著意義(p<0.05);精芪雙參中劑量組可顯著延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間及斷頭后的喘息次數(shù),與空白組比較非常顯著意義(p<0.01);而高劑量組可延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間及有效抑制腦指數(shù)的增長(zhǎng),與空白組比較有顯著意義(p<0.05),結(jié)果見表1。
表1 對(duì)急性腦缺血小鼠存活時(shí)間和喘氣次數(shù)的影響(±s,n=10)
表1 對(duì)急性腦缺血小鼠存活時(shí)間和喘氣次數(shù)的影響(±s,n=10)
注:與空白對(duì)照組比較*p<0.05,**p<0.01。
組別 劑量(g·kg-1) 存活時(shí)間(s) 喘氣次數(shù) 腦指數(shù)(%) 腦含水量(%)空白組 —— 17.7±2.37 12.5±1.38 2.05±0.018 77.1±3.66鹽酸氟桂利嗪組 3.9 19.8±1.81* 13.9±1.52* 1.93±0.012* 73.3±3.71*高劑量組 1800 18.07±2.60* 13.6±1.63 1.89±0.016* 75.8±1.63中劑量組 1080 21.7±3.38** 14.1±1.30** 1.91±0.019 76.6±1.47低劑量組 360 17.35±3.73 13.0±1.32 2.04±0.014 76.0±0.46
3.2對(duì)大鼠腦缺血再灌注的影響
3.2.1對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分差異 模型對(duì)照組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較高,說明腦缺血較嚴(yán)重,與假手術(shù)組較具有顯著意義(p<0.001),鹽酸氟桂利嗪組,高、中劑量組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低,表明藥物發(fā)揮一定的保護(hù)作用,與模型對(duì)照組比較有顯著意義(p<0.05,p<0.01),結(jié)果見表 2。
表2 對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s,n=10)
表2 對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(±s,n=10)
注:與假手術(shù)組比較###p<0.001,與模型對(duì)照組比較*p<0.05,**p<0.01。
組別 劑量(mg·kg-1) 評(píng)分假手術(shù)組 —— 0模型對(duì)照組 —— 2.1±0.8###鹽酸氟桂利嗪組 2 1.3±0.5*高劑量組 1000 1.4±0.6**中劑量組 500 1.4±0.5**低劑量組 250 1.7±0.7
3.2.2對(duì)血清生化指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組含量明顯增高(p<0.001);與模型對(duì)照組比較,精芪雙參膠囊中、高劑量組及鹽酸氟桂利嗪組可明顯抑制大鼠炎性因子,降低IL-1β、TNF-α在大鼠血清中含量,與模型對(duì)照組比較有意義(p<0.05,p<0.01),結(jié)果見表 3。
表3 對(duì)大鼠血清IL-1β、TNF-α的影響(±s,n=10)
表3 對(duì)大鼠血清IL-1β、TNF-α的影響(±s,n=10)
注:與假手術(shù)組組比較###p<0.001,與模型對(duì)照組比較*p<0.05,**p<0.01。
組別 劑量 (mg·kg-1) IL-1β(ng·L-1)TNF-α(ng·L-1)假手術(shù)組 —— 23.5±15.0 122.4±5.3模型對(duì)照組 —— 58.2±12.0### 173.6±10.7###鹽酸氟桂利嗪組 2 32.6±8.2*** 150.4±3.5**高劑量組 1000 37.6±14.3* 163.9±3.7*中劑量組 500 34.3±23.1** 152.7±6.2**低劑量組 250 44.8±26.1 170.8±7.3
3.2.3對(duì)腦組織中SOD、MDA和LDH的影響 模型對(duì)照組大鼠腦組織LDH和MDA釋放增加,SOD活力明顯降低,與假手術(shù)組比較有顯著性差異(p<0.05,p<0.001)。精芪雙參膠囊中劑量組可明顯抑制大鼠腦組織中LDH和MDA含量的釋放,鹽酸非桂利嗪組,高、中劑量組提高SOD活力變化,與模型對(duì)照組比較有意義(p<0.05,p<0.01),結(jié)果見表 4。
表4 對(duì)大鼠腦組織SOD、MDA和LDH的影響(±s,n=10)
表4 對(duì)大鼠腦組織SOD、MDA和LDH的影響(±s,n=10)
LDH(U·L-1)假手術(shù)組 —— 208.5±20.1 45.0±2.7 1342.3±331.5模型對(duì)照組 —— 153.8±28.6?!?7.6±3.5### 2496.1±311.3###鹽酸氟桂利嗪組 2 173.0±23.3* 53.6±3.1** 2296.7±246.5**高劑量組 1000 182.4±19.7* 61.1±4.0 2075.5±359.2中劑量組 500 167.4±25.6* 59.2±3.3** 1535.9±292.4*低劑量組 250 157.6±20.3 63.7±3.7 2084.9±445.4組別 劑量(mg·kg-1)SOD(U·mgprot-1)MDA(nmol·mgprot-1)
3.2.4大鼠腦梗死面積
模型對(duì)照組大鼠腦缺血面積明顯增大,鹽酸氟桂利嗪組、精芪雙參膠囊高、中劑量組可有效縮小腦缺血大鼠腦梗死面積,與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(p<0.05,p<0.001),結(jié)果見表 5。
表5 對(duì)大鼠腦梗死面積的影響(±s,n=10)
表5 對(duì)大鼠腦梗死面積的影響(±s,n=10)
注:與假手術(shù)組比較###p<0.001,與模型對(duì)照組比較*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
組別 劑量(mg·kg-1) 梗死面積百分比(%)假手術(shù)組 —— 1.4模型對(duì)照組 —— 47.9###鹽酸氟桂利嗪組 2 14.1***高劑量組 1000 23.8**中劑量組 500 29.5*低劑量組 250 32.9
小鼠急性斷頭后,腦部血液供應(yīng)中斷,腦能量代謝發(fā)生障礙,但腦中原有的血液和營養(yǎng)物質(zhì)尚能使腦功能維持一段時(shí)間,表現(xiàn)為小鼠有規(guī)律的喘氣,當(dāng)能量消耗至一定程度,活動(dòng)終止[7]。本研究顯示精芪雙參膠囊可明顯改善小鼠腦部的供血供氧,從而延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間及斷頭后的喘息次數(shù),降低腦指數(shù)和腦含水量。
氧自由基學(xué)說在腦缺血再灌注損傷機(jī)制中占有重要地位[12]。大鼠腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)中,精芪雙參膠囊通過保護(hù)提高超氧化物歧化酶SOD活力,抑制脂質(zhì)過氧化物MDA的釋放降低氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)腦組織缺血的作用。大量的文獻(xiàn)表明,大鼠腦缺血后會(huì)引起TNF-α、IL-1β等炎癥因子的大量生成,進(jìn)而引起腦細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,TNF-α、IL-1β在腦缺血性損傷中起著重要的作用[13-14]。精芪雙參膠囊在腦缺血損傷中,抑制了炎癥因子TNF-α、IL-1β的生成,進(jìn)而減少急性腦缺血對(duì)大腦的損傷;另外由于缺血損傷造成血腦屏障的破壞,導(dǎo)致細(xì)胞周圍間隙的液體增加,進(jìn)一步加重細(xì)胞水腫甚至凋亡,引起組織能量供應(yīng)的缺乏而產(chǎn)生腦組織梗死。精芪雙參膠囊能明顯地縮小腦組織受損引起的梗死面積。
本文通過小鼠急性腦缺血、大鼠腦缺血再灌注模型研究精芪雙參膠囊對(duì)腦組織保護(hù)作用,為精芪雙參膠囊的開發(fā)利用提供依據(jù)。
[1] 汪晶,彭蘊(yùn)茹,戴岳,通腦舒絡(luò)膠囊對(duì)腦缺血缺氧的保護(hù)作用和康寧抗栓作用[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2007,28(5):37-38.
[2] 王小平,倪京滿.腦缺血再灌注損傷的研究及藥物治療進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥雜志,2016,25(6):659-663.
[3] 葉云,鄧洪波,李友元.黃精多糖對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2006,23(3):292-293.
[4] 張麗君,呂文偉,王志.人參花蕾皂苷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的抗氧化作用及其機(jī)制[J].中草藥,2005,36(11):1693-1694.
[5] 張涵亮,于曉風(fēng),曲紹春,人參Rb組皂苷對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2011,31(12):2247-2249.
[6] 王洪祥,徐彬,萬海同.黃芪對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠MMP-9和IL-1β的影響[J].海峽藥學(xué),2013,25(4):17-19.
[7] 陳奇.中藥藥理學(xué)研究方法學(xué)[M].第三版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:769.
[8] 何芳雁,韓春妮,李艷.制作線栓法大鼠腦缺血再灌注模型的在要點(diǎn)及體會(huì)[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2013,30(4):46-48.
[9] 王麟鵬,程金蓮,張露芬,“賀氏三通法”針刺治療對(duì)腦缺血再灌注大鼠血清IL-1及TNF-α含量的影響[J].中國中醫(yī)急癥,2010,10(5):814-815
[10] 陳曉娟,肖宗宇,潘琪,改良線栓法大鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2015,12(3):24-27.
[11] 朱士光,楊榮禮,耿德勤.局灶性腦缺血大鼠z-Longa評(píng)分的MRI研究[J].國際老年醫(yī)學(xué)雜志,2012,33(5):199-201.
[12] 宮建偉,葉蕾,張秀麗,地黃飲子對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠血清、腦組織SOD、CAT和GSH-Px及MDA的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(14):247-250.
[13] 蘇婧,石孟瓊,賀海波,珠子參水提物對(duì)小鼠急性腦缺血損傷的影響[J].中國老年病學(xué),2012,32(6):1217-1220.
[14] 張帆,張小磊,苗明.毛冬青總黃酮對(duì)小鼠腦缺血模型的影響[J].中國老年病學(xué),2012,32(6):1217-1220.