唐曉桐 徐 建 許艷茹 于艷輝 石 菊 邢 成 鄭廣晶 崔憲利 白 冰

（吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司 長(zhǎng)春·130012）

精芪雙參膠囊由黃芪、丹參、人參、黃精四味藥組成，補(bǔ)氣養(yǎng)陰，活血化瘀，養(yǎng)心安神；適用于心腦血管疾病之心悸氣短，頭暈頭痛，倦怠乏力，耳鳴眼花等病癥。腦缺血再灌注損傷既包括急性細(xì)胞壞死也包括細(xì)胞凋亡。腦缺血再灌注后神經(jīng)損傷是一個(gè)復(fù)雜的超聯(lián)反應(yīng)，項(xiàng)目：“雙十工程”重大科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（20150301009YY）。吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

其損傷機(jī)制主要是與細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基損傷、興奮性氨基酸增加、炎癥因子釋放及酶類等因素有關(guān)[1-2]的復(fù)雜的多因素過程。大量文獻(xiàn)報(bào)道黃精多糖、人參花蕾皂苷、人參Rb組皂苷和黃芪等成分都有保護(hù)腦損傷的作用[3-6]。

缺血性腦血管疾病的發(fā)病率、致殘率和病死率均較高，一般以局灶性腦缺血為主，其中大腦中動(dòng)脈栓塞造成的腦梗死最為多見，因此精芪雙參膠囊在腦缺血疾病的治療方面有廣闊前景。

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與器材

1.1動(dòng)物ICR小鼠，雌雄各半，6-8周齡，體重18-22g；SD大鼠，雌雄各半，體重230-250g；均購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉 )-2014-0003。

1.2藥物與試劑精芪雙參膠囊：棕色粉末，由吉林長(zhǎng)白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，批號(hào)：20150829；鹽酸氟桂利嗪膠囊，西安楊森制藥有限公司，批號(hào)：150327791；TTC：貨號(hào)T8170；甲醛，批號(hào)：170305，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；無水乙醇，批號(hào)：20151215，北京化工廠；腫瘤壞死因子-α,批號(hào):20170208，南京建成生物工程研究所；白介素-1β：批號(hào)：20170208，南京建成生物工程研究所。

1.3儀器MCAO線栓，型號(hào)：2634-A4、2636-A4，北京西濃科技有限公司。酶標(biāo)儀SMP-500-18272-LSI0型：Manufactured in China Designed in California USA ；精密電子天平ESJ60-4：沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機(jī)LDZ5-2型：北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

2　方法

2.1對(duì)小鼠腦缺血后存活時(shí)間的影響[7]

2.1.1分組及方法ICR小鼠50只，隨機(jī)分為空白組，鹽酸氟桂利嗪組（3mg·kg-1），精芪雙參高、中、低劑量組（1800、1080、360mg·kg-1），每組10只，灌胃給藥10ml·kg-1，連續(xù)7d。末次給藥后1h在小鼠耳后2mm處快速斷頭，使頭落到預(yù)熱至37℃的水浴箱上，然后記錄小鼠斷頭后的呼吸次數(shù)及呼吸維持時(shí)間(以小鼠張口喘息為判斷標(biāo)準(zhǔn))。

2.1.2檢測(cè)指標(biāo)腦組織含水量及腦指數(shù)測(cè)定：于冷凍冰袋上快速開顱取腦，以-4℃生理鹽水洗凈血漬用濾紙吸干，用眼科鑷子和手術(shù)刀片取下嗅球、小腦及低位腦干，留取大腦，將腦分別置于電子天平(萬分之一)稱濕重。然后將腦放于烘箱中恒溫100℃，24h持續(xù)烘干，然后稱大腦干重，計(jì)算腦含水量。（腦含水量=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%；腦指數(shù)=腦濕重/體重×100%）

2.2大鼠腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)[8-10]

2.2.1分組及方法 SD大鼠90只，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型對(duì)照組，鹽酸氟桂利嗪組(2mg·kg-1)，精 芪 雙 參 高、 中、 低 劑 量 組（1000、500、250mg·kg-1），每組15只，灌胃給藥10ml/kg，連續(xù)給藥7d，手術(shù)前12 h動(dòng)物術(shù)前禁食不禁水，于末次給藥后1h，用戊巴比妥鈉（45mg·kg-1）麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定，用碘伏潤(rùn)濕頸部毛，用手術(shù)剪刀將大鼠頸部正中切口約20-25mm，分離皮下結(jié)締組織。分開頸前肌群，剝離神經(jīng)，暴露頸總動(dòng)脈，沿頸總動(dòng)脈向上剝離可見頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），用手術(shù)線將ECA、ECA分支枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈和ECA的終末支遠(yuǎn)心端結(jié)扎，再在近心端并遠(yuǎn)離勁總動(dòng)脈的地方結(jié)扎，使頸外動(dòng)脈兩個(gè)結(jié)扎點(diǎn)之間有一定距離。CCA、ICA用動(dòng)脈夾夾閉，把ECA遠(yuǎn)心端拉直與ICA成一條直線，用眼科手術(shù)剪在ECA上剪一小口。將線栓彎曲向屋頂方向從ECA插入ICA，扎緊分叉處手術(shù)線，移去ICA上的動(dòng)脈夾，進(jìn)入ICA。缺血2h后，拔出線栓進(jìn)行再灌注。

2.2.2動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[11]腦缺血再灌注后將蘇醒后的動(dòng)物放回籠內(nèi)，使其自由飲食。24h后按z-Longa評(píng)分法隨機(jī)評(píng)估并記錄神經(jīng)功能缺損評(píng)分：無功能障礙記為0分；不能伸展右側(cè)前肢記為1分；向右側(cè)旋轉(zhuǎn)記為2分；向右側(cè)傾倒記為3分；無自主活動(dòng)伴意識(shí)障礙記為4分；死亡記為5分。分?jǐn)?shù)越高，表示動(dòng)物神經(jīng)功能損傷越大。滿足1分、2分和3分的動(dòng)物為造模成功。

2.2.3檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，2500r·min-1離心10min后分離血清，ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β。

2.2.4測(cè)定腦組織勻漿中SOD、MDA和LDH活性 冰盒上取腦組織，用眼科鑷子去除嗅球，用生理鹽水按腦組織：生理鹽水=1:9勻漿，制成10%勻漿液，3000r·min-1離心15min，按照試劑盒說明書，測(cè)定SOD、MDA和LDH活性。

2.2.5腦梗死面積 大鼠麻醉后斷頭取腦，冰生理鹽水預(yù)處理10min，自前向后切成5片，每片切成2mm厚。0.25%TTC溶液染色，37℃避光孵育30min（每隔10分鐘翻動(dòng)一次），染色完成后用10%甲醛溶液固定，數(shù)碼相機(jī)拍照，用圖片處理軟件計(jì)算腦梗死容積百分比(紅色為正常腦組織，白色為腦梗死組織)。

2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠腦缺血后存活時(shí)間的影響

陽性對(duì)照組可以明顯延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間及斷頭后的喘息次數(shù)，并能降低腦指數(shù)及腦含水量的增加，與空白組比較有顯著意義（p＜0.05）；精芪雙參中劑量組可顯著延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間及斷頭后的喘息次數(shù)，與空白組比較非常顯著意義（p＜0.01）；而高劑量組可延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間及有效抑制腦指數(shù)的增長(zhǎng)，與空白組比較有顯著意義（p＜0.05），結(jié)果見表1。

表1　對(duì)急性腦缺血小鼠存活時(shí)間和喘氣次數(shù)的影響（±s，n=10）

表1　對(duì)急性腦缺血小鼠存活時(shí)間和喘氣次數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較*p＜0.05，**p＜0.01。

組別　　劑量（g·kg-1）　　存活時(shí)間（s）　　喘氣次數(shù)　　腦指數(shù)（%）　　腦含水量（%）空白組　　——　17.7±2.37　12.5±1.38　2.05±0.018　77.1±3.66鹽酸氟桂利嗪組　3.9　19.8±1.81*　13.9±1.52*　1.93±0.012*　73.3±3.71*高劑量組　1800　18.07±2.60*　13.6±1.63　1.89±0.016*　75.8±1.63中劑量組　1080　21.7±3.38**　14.1±1.30**　1.91±0.019　76.6±1.47低劑量組　360　17.35±3.73　13.0±1.32　2.04±0.014　76.0±0.46

3.2對(duì)大鼠腦缺血再灌注的影響

3.2.1對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分差異 模型對(duì)照組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較高，說明腦缺血較嚴(yán)重，與假手術(shù)組較具有顯著意義（p＜0.001），鹽酸氟桂利嗪組，高、中劑量組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低，表明藥物發(fā)揮一定的保護(hù)作用，與模型對(duì)照組比較有顯著意義（p＜0.05，p＜0.01），結(jié)果見表 2。

表2　對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（±s，n=10）

表2　對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較＃＃＃p＜0.001，與模型對(duì)照組比較*p＜0.05，**p＜0.01。

組別　　劑量(mg·kg-1)　　評(píng)分假手術(shù)組　　——　0模型對(duì)照組　　——　2.1±0.8＃＃＃鹽酸氟桂利嗪組　2　1.3±0.5*高劑量組　1000　1.4±0.6**中劑量組　500　1.4±0.5**低劑量組　250　1.7±0.7

3.2.2對(duì)血清生化指標(biāo)的影響 與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組含量明顯增高（p＜0.001）；與模型對(duì)照組比較，精芪雙參膠囊中、高劑量組及鹽酸氟桂利嗪組可明顯抑制大鼠炎性因子，降低IL-1β、TNF-α在大鼠血清中含量，與模型對(duì)照組比較有意義（p＜0.05，p＜0.01），結(jié)果見表 3。

表3　對(duì)大鼠血清IL-1β、TNF-α的影響（±s，n=10）

表3　對(duì)大鼠血清IL-1β、TNF-α的影響（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組組比較＃＃＃p＜0.001，與模型對(duì)照組比較*p＜0.05，**p＜0.01。

組別　　劑量 (mg·kg-1） IL-1β（ng·L-1）TNF-α（ng·L-1）假手術(shù)組　　——　23.5±15.0　122.4±5.3模型對(duì)照組　　——　58.2±12.0＃＃＃ 173.6±10.7＃＃＃鹽酸氟桂利嗪組　2　32.6±8.2***　150.4±3.5**高劑量組　1000　37.6±14.3*　163.9±3.7*中劑量組　500　34.3±23.1**　152.7±6.2**低劑量組　250　44.8±26.1　170.8±7.3

3.2.3對(duì)腦組織中SOD、MDA和LDH的影響 模型對(duì)照組大鼠腦組織LDH和MDA釋放增加，SOD活力明顯降低，與假手術(shù)組比較有顯著性差異（p＜0.05，p＜0.001）。精芪雙參膠囊中劑量組可明顯抑制大鼠腦組織中LDH和MDA含量的釋放，鹽酸非桂利嗪組，高、中劑量組提高SOD活力變化，與模型對(duì)照組比較有意義（p＜0.05，p＜0.01），結(jié)果見表 4。

表4　對(duì)大鼠腦組織SOD、MDA和LDH的影響（±s，n=10）

表4　對(duì)大鼠腦組織SOD、MDA和LDH的影響（±s，n=10）

LDH（U·L-1）假手術(shù)組　　——　208.5±20.1　45.0±2.7　1342.3±331.5模型對(duì)照組　　——　153.8±28.6?！?7.6±3.5＃＃＃　2496.1±311.3＃＃＃鹽酸氟桂利嗪組　2　173.0±23.3*　53.6±3.1**　2296.7±246.5**高劑量組　1000　182.4±19.7*　61.1±4.0　2075.5±359.2中劑量組　500　167.4±25.6*　59.2±3.3**　1535.9±292.4*低劑量組　250　157.6±20.3　63.7±3.7　2084.9±445.4組別　　劑量(mg·kg-1)SOD（U·mgprot-1）MDA（nmol·mgprot-1）

3.2.4大鼠腦梗死面積

模型對(duì)照組大鼠腦缺血面積明顯增大，鹽酸氟桂利嗪組、精芪雙參膠囊高、中劑量組可有效縮小腦缺血大鼠腦梗死面積，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異（p＜0.05，p＜0.001），結(jié)果見表 5。

表5　對(duì)大鼠腦梗死面積的影響（±s，n=10）

表5　對(duì)大鼠腦梗死面積的影響（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較＃＃＃p＜0.001，與模型對(duì)照組比較*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

組別　　劑量（mg·kg-1）　　梗死面積百分比（%）假手術(shù)組　　——　1.4模型對(duì)照組　　——　47.9＃＃＃鹽酸氟桂利嗪組　2　14.1***高劑量組　1000　23.8**中劑量組　500　29.5*低劑量組　250　32.9

4　討論

小鼠急性斷頭后，腦部血液供應(yīng)中斷，腦能量代謝發(fā)生障礙，但腦中原有的血液和營養(yǎng)物質(zhì)尚能使腦功能維持一段時(shí)間，表現(xiàn)為小鼠有規(guī)律的喘氣，當(dāng)能量消耗至一定程度，活動(dòng)終止[7]。本研究顯示精芪雙參膠囊可明顯改善小鼠腦部的供血供氧，從而延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間及斷頭后的喘息次數(shù)，降低腦指數(shù)和腦含水量。

氧自由基學(xué)說在腦缺血再灌注損傷機(jī)制中占有重要地位[12]。大鼠腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)中，精芪雙參膠囊通過保護(hù)提高超氧化物歧化酶SOD活力，抑制脂質(zhì)過氧化物MDA的釋放降低氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)腦組織缺血的作用。大量的文獻(xiàn)表明，大鼠腦缺血后會(huì)引起TNF-α、IL-1β等炎癥因子的大量生成，進(jìn)而引起腦細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，TNF-α、IL-1β在腦缺血性損傷中起著重要的作用[13-14]。精芪雙參膠囊在腦缺血損傷中，抑制了炎癥因子TNF-α、IL-1β的生成，進(jìn)而減少急性腦缺血對(duì)大腦的損傷；另外由于缺血損傷造成血腦屏障的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞周圍間隙的液體增加，進(jìn)一步加重細(xì)胞水腫甚至凋亡，引起組織能量供應(yīng)的缺乏而產(chǎn)生腦組織梗死。精芪雙參膠囊能明顯地縮小腦組織受損引起的梗死面積。

5　結(jié)論

本文通過小鼠急性腦缺血、大鼠腦缺血再灌注模型研究精芪雙參膠囊對(duì)腦組織保護(hù)作用，為精芪雙參膠囊的開發(fā)利用提供依據(jù)。

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