馮興軍，李丹，朱健，劉超群，高偉，陳惠嫻

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

鴨抗菌肽Cathelicidin的衍生物設計及抑菌機制研究

馮興軍，李丹，朱健，劉超群，高偉，陳惠嫻

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

鴨抗菌肽Cathelicidin分子[Cath(1-20)]富含疏水性氨基酸及正電荷，通過人工方法設計合成Cath(1-20)的截短肽衍生物，篩選新型安全Cath(1-20)衍生肽，探討其作用機制。結果表明，與母肽Cath(1-20)相似，三種衍生肽Cath(5-20)、Cath(4-20)、Cath(3-20)均具有明顯廣譜抑菌活性，MIC值在1～8μmol·L-1范圍內(nèi)，但僅Cath (5-20)溶血及細胞毒性明顯降低，治療指數(shù)達19.5，顯著高于Cath(1-20)、Cath(4-20)及Cath(3-20)。Cath(1-20)及其衍生肽可破壞E.coli UB1005的內(nèi)膜完整性，產(chǎn)生去極化作用，并存在時間和劑量依賴效應；透射電鏡結果顯示Cath(1-20)及Cath(5-20)可破壞細菌細胞膜。研究證實氨基端的色氨酸對鴨抗菌肽Cath(1-20)溶血及細胞毒性起關鍵作用，其作用靶點主要為細菌細胞膜。

抗菌肽；鴨；色氨酸；抑菌活性；作用機制

抗菌肽是由生物細胞特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，是有機體非特異性免疫重要組成部分[1]，參與特異性免疫功能，在宿主先天和適應性免疫功能中發(fā)揮重要作用。

抗菌肽，對細菌、真菌、病毒、寄生蟲，甚至腫瘤細胞具有抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性[2-3]，成為新型抗菌制劑研究熱點[4]。然而價格昂貴、抗菌活性不理想、甚至存在溶血及細胞毒性等問題限制其研發(fā)應用。因此在研究抗菌肽構效關系及作用機制基礎上，以自然存在抗菌肽為模板作改造和設計，篩選理想的新型抗菌肽分子成為重要研發(fā)方向[5-7]。

Cathelicidins是廣泛存在于人和動物體內(nèi)的一類抗菌肽，Cathelicidins前體由三部分構成，N端信號肽、C端功能肽以及中間保守cathelin域三部分組成。受特定因子刺激時，C-端成熟肽被蛋白酶水解，發(fā)揮生物學功能[8]。Cathelicidins抗菌肽可直接抑制和殺死各種病原體，具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，抑制組織損傷、加快傷口修復、促進血管生成等重要生物學功能[9]。

鴨抗菌肽Cath（1-20）是鴨體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一種Cathelicidins抗菌肽，抑菌活性較強但對真核細胞毒副作用較大[10]。本研究以設計抗菌肽Cath（1-20）為切入點，篩選細胞選擇性高的Cath（1-20）抗菌肽衍生物，闡明Cath（1-20）構效關系，探討其抑菌機制，為開發(fā)新型抗菌肽分子提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及細胞

革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）、大腸桿菌（Escherichia coliUB 1005）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorumC79-13）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuriumC77-31），革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusATCC 29213）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidisATCC 12228）、糞鏈球菌（EnterococcusfaecalisATCC 29212）及人胚胎成纖維細胞MRC-5均為東北農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所保存。

1.1.2 試劑

Mueller Hilton肉湯（MHB）培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、牛血清白蛋白（BSA）購自浙江天杭生物科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）購自Amresco（美國）；Triton X-100、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、細胞熒光探針diSC3-5購自Sigma-Aldrich（中國）；抗菌肽Cath（1-20）及其衍生肽由上海吉爾生化有限公司采用固相合成法合成，多肽純度及分子量利用ACQUITYTM高效液相色譜和Waters XevoTMTQMS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS，美國Waters公司）測定。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 肽的設計與合成

利用截取法從氨基端依次刪除氨基酸殘基，設計合成Cath（1-20）三種衍生肽Cath（5-20）、Cath（4-20）、Cath（3-20）（序列見表1），純度大于95%?？咕睦砘瘏?shù)利用在線工具ProtParam（ExPASyroteomics Server:http://www.expasy.org/tools/ protparam.htm l）及抗菌肽數(shù)據(jù)庫（http://aps.unmc. edu/AP/main.ph）計算獲得。

1.2.2 最小抑菌濃度測定

最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentrations，MIC）測定參照文獻[11]方法。待測菌接種于MHB培養(yǎng)基中，220 r·min-1、37℃過夜培養(yǎng)，轉移至新鮮MHB中，繼續(xù)培養(yǎng)至生長對數(shù)期。MHB校正細菌濃度至OD600=0.5，將菌體濃度調(diào)整為105cfu·mL-1。將肽溶解于50μL 0.2%BSA（包含0.01%乙酸）溶液，分別取活化培養(yǎng)的菌液50 μL，接種于96孔培養(yǎng)板中，加入溶解抗菌肽（物質(zhì)的量濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μmol·L-1），50μL，37℃培養(yǎng)16～18 h。未加菌孔作為陰性對照，加菌液和MHB孔作為陽性對照，每孔3個平行，3次獨立試驗。無肉眼可見細菌生長的最低抗菌肽濃度即為該測定抗菌肽對檢測菌MIC。

1.2.3 溶血活性測定

參照文獻[12]方法通過溶血活性檢測肽對哺乳動物血紅細胞溶解能力。肝素鈉抗凝管收集健康人血液，1 000 r·min-1離心5min，棄上清，收集血紅細胞，PBS沖洗3遍，重懸后，得到血紅細胞懸液。將肽溶解于PBS中，與紅細胞懸液混合，肽終濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μmol·L-1）。以僅加PBS為陰性對照，以含0.2%Triton X-100為陽性對照。37℃孵育1 h，然后1 000 r·min-1，4℃離心5min，吸取上清，酶標儀測定OD570條件下吸光值。每個多肽溶液做3個平行，每組取平均值，3次獨立試驗。將引起5%溶血活性對應的最低肽濃度定義為最小溶血濃度（Minimal hemolytic concentration，MHC）?？咕娜苎视嬎愎剑?/p>

A：抗菌肽樣品處理組吸光度值；

At：0.2%Triton X-100陽性對照吸光度值；A0：PBS陰性對照吸光度值。

1.2.4 細胞毒性測定

利用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液將對數(shù)生長期的MRC-5細胞配成細胞懸液，以每孔2×104個細胞接種到96孔板中，分別加入不同濃度抗菌肽，5%CO2、37℃培養(yǎng)18～24 h，每孔加MTT溶液（0.5mg·mL-1用PBS配制，pH7.4）50μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩10min，使結晶物充分融解，測定570 nm吸光值。細胞存活率計算公式：

細胞存活率（%）=（A570處理組）/（A570對照組）×100%。

1.2.5 對細菌細胞膜通透性影響

取對數(shù)期大腸桿菌UB1005菌液（108cfu·mL-1）200μL，PBS（pH 7.4）洗滌兩次，加入作用濃度為1.5mmol·mL-1的ONPG溶液與1×MIC濃度的抗菌肽溶液，37℃處理1 h，每5min測定420 nm吸光值，不加任何藥物作用的菌體組作為陰性對照，以0.2%Triton X-100作用的菌體作為陽性對照。

1.2.6 對細菌細胞膜的去極化作用

參照文獻[13]方法，利用細胞膜電勢能敏感型熒光染料diSC3-5測定抗菌肽對細胞膜的去極化作用。大腸桿菌UB1005培養(yǎng)至對數(shù)生長期，4 000 r·min-1離心5 min，收集菌體，5mmol·L-1HEPES緩沖液（pH 7.4，含20 mmol·L-1葡萄糖和5 mmol·L-1EDTA）洗滌3次后，重懸稀釋至OD600= 0.05。向配制的細菌懸浮液中加入終濃度為0.4 μmol·L-1的diSC3-5，室溫避光振蕩孵育1 h。再加入終濃度為0.1mol·L-1的KCl，室溫振蕩避光孵育15～30 min，取2mL細菌懸浮液于石英比色皿中，加入不同濃度抗菌肽，在激發(fā)波長622 nm，發(fā)射波長670 nm條件下測定熒光強度。

1.2.7 透射電鏡檢測

取對數(shù)期大腸桿菌ATCC25922，4000 r·mL-1離心5min，收集菌體，10 mmol·L-1PBS洗滌后，PBS重懸稀釋至OD600=0.2，1×MIC濃度的抗菌肽溶液37℃作用1 h，4 000 r·mL-1離心5 min，收集菌體，PBS洗滌3次。5%戊二醛固定2～4 h，PBS洗滌3次，1%鋨酸固定80min。離心洗滌，乙醇梯度（50、70、90、100%）脫水，繼續(xù)用1：1的100%乙醇丙酮混合液、丙酮處理，環(huán)氧樹脂包埋。切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，HITACHIH-7650透射電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 肽的設計及其分子特性

由表1可知，通過電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）檢測化學合成的肽分子質(zhì)量與其理論分子質(zhì)量一致，表明Cath（1-20）及設計的三種衍生肽合成成功。肽平均疏水性由Kyte&Doolittl檢測，母肽及其三種衍生肽疏水性不強，三種衍生肽正電荷均為+5。

2.2 溶血活性

由圖1可知，母肽Cath（1-20）具有極強溶血活性，在128μmol·L-1濃度下溶血率超過95%，Cath（3-20）也表現(xiàn)極強溶血活性，與母肽溶血活性相當，Cath（4-20）在低濃度下溶血活性較母肽明顯降低，但高濃度下溶血活性較強，Cath（5-20）未表現(xiàn)明顯溶血活性，即使在最高濃度下（128μmol·L-1），溶血率僅為18%。母肽Cath（1-20）及三種衍生肽Cath（3-20）、Cath（4-20）、Cath（5-20）引起人血紅細胞發(fā)生5%溶血的最小濃度分別為2、2、8、64μmol·L-1。

表1 肽的物理化學參數(shù)Table 1 Physicochem ical param etersof the peptides

圖1 肽的溶血活性Fig.1 Hemolytic activity of the peptides

2.3 細胞毒性

由圖2可知，母肽Cath（1-20）及其三種衍生肽Cath（3-20）、Cath（4-20）、Cath（5-20）細胞毒性呈劑量依賴性，隨抗菌肽濃度增加，細胞毒性逐漸增強。Cath（1-20）及Cath（3-20）具有極強細胞毒性，Cath（5-20）細胞毒性較母肽明顯降低，在低濃度時細胞毒性很低，在128μmol·L-1，細胞死亡為40%，而其他三種肽在該濃度下細胞死亡率均超過90%。

圖2 肽的細胞毒性Fig.2 Toxicity of the pep tides

2.4 抑菌活性

采用微量肉湯稀釋法測定母肽Cath（1-20）及其三種衍生肽Cath（3-20）、Cath（4-20）、Cath（5-20）體外抑菌活性，見表2。

由表2可知，所有抗菌肽對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有較強抑菌活性，MIC為1～8μmol·L-1。與母肽Cath（1-20）相比，三種衍生肽抑菌活性變化不大，但均有一定程度提高。母肽Cath（1-20）治療指數(shù)很低，僅為0.55，三種衍生肽治療指數(shù)均提高，尤其是Cath（5-20），治療指數(shù)達到19.51，較母肽提高35倍，表明Cath（5-20）具有極好細胞選擇性。

2.5 對細菌細胞膜通透性影響

試驗利用β-半乳糖苷酶對ONPG水解檢測抗菌肽對細菌細胞膜通透性影響。β-半乳糖苷酶是細菌細胞質(zhì)膜上水解酶，當細胞膜被破壞后，細胞膜通透性改變，β-半乳糖苷酶釋放到細胞外，同時ONPG進入細胞內(nèi)部，細胞內(nèi)外β-半乳糖苷酶與ONPG作用，將其水解成半乳糖和黃色鄰硝基苯酚，通過培養(yǎng)液OD值變化得知β-半乳糖苷酶活性，評價細菌細胞膜通透性變化。由圖3可知，母肽Cath（1-20）及三種衍生肽均可迅速破壞細菌內(nèi)膜，呈時間依賴性，說明抗菌肽作用于細胞膜靶向性，通過破壞細胞膜通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)流至胞外而達到殺菌目的。

表2 肽的最小抑菌濃度、最小溶血濃度及治療指數(shù)Table2 M IC,MHC and TIof the pep tideand itsderivatives

圖3 肽對大腸桿菌UB1005細胞膜通透性影響Fig.3 Effectof the peptideson themembrane permeability of E.coli UB1005

2.6 細菌細胞質(zhì)膜去極化

diSC3-5作為一種膜電位敏感染料，進入細胞后發(fā)生聚集并自行熒光淬滅。如果膜被破壞或形成通道，diSC3-5將釋放到介質(zhì)中引起熒光增加，表明細胞膜去極化過程。因此可通過檢測熒光釋放量衡量抗菌肽對細胞質(zhì)膜破壞程度。由圖4可見，隨著肽加入，可檢測細菌細胞膜發(fā)生去極化，其強度具有時間效應。母肽Cath（1-20）去極化過程的速度與強度最弱。三種衍生肽均強于母肽，其中Cath（4-20）最強，Cath（3-20）次之，Cath（5-20）最低，說明Cath（1-20）及其衍生肽可更快更有效破壞細胞內(nèi)膜。

圖4 肽對大腸桿菌UB1005細胞膜去極化作用Fig.4 Cytop lasm icm em brane depolarization of thepeptide against E.coli UB1005

2.7 對細菌結構影響

未加抗菌肽和抗菌肽作用1 h后大腸桿菌透射電鏡照片（見圖5）。未加抗菌肽作用的對照菌體（圖5 A）細胞膜邊緣清晰完整，內(nèi)部結構致密，胞質(zhì)內(nèi)容物未見明顯散失。而經(jīng)抗菌肽處理大腸桿菌菌體（圖5B、C）細胞膜不完整，胞膜形態(tài)混亂。內(nèi)部結構和對照組相比改變明顯，內(nèi)容物釋放，形成“鬼影”細胞（失去細胞質(zhì)但具有細胞壁等外架結構）。電鏡圖反映抗菌肽對細胞膜完整性的破壞，導致細胞內(nèi)容物釋放。

圖5 大腸桿菌ATCC25922在抗菌肽作用后結構形態(tài)變化Fig.5 Structu ral change of E.coli ATCC 25922 treated w ith pep tides

3 討論

抗菌肽作為抗生素替代物，不易產(chǎn)生耐藥性、無殘留、無污染，作為新型抗菌藥物已在廣泛應用。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽抗菌活性仍不理想，甚至存在細胞毒副作用。結構改造天然抗菌肽是克服天然肽鏈毒性最常用方法，效果理想。以天然抗菌肽為模板，通過氨基酸替換、自身氨基酸刪減與截短、截取兩種或兩種以上抗菌肽片段拼接是改良抗菌肽抑菌活性、消除細胞毒副作用的有效方法[13-15]。

抗菌肽依賴自帶正電荷與細菌細胞膜上負電荷基團發(fā)生靜電吸引相互結合[16]?？咕淖詭ё銐蛘姾?，是抗菌肽與細菌結合，發(fā)揮抑菌作用前提。帶有正電荷氨基酸，如精氨酸（R）、賴氨酸（K）是抗菌肽抑菌活性關鍵。抗菌肽需這些氨基酸提供正電荷與氫鍵才可與帶有負電荷細菌質(zhì)膜結合。研究表明，利用精氨酸或賴氨酸替代抗菌肽原有氨基酸，增加抗菌肽陽離子特性及其正電荷，可顯著增強抗菌肽與細菌質(zhì)膜結合力，提高抗菌肽抑菌活性[17-19]。鴨抗菌肽Cath（1-20）在氨基酸與羧基端均富含精氨酸和賴氨酸。本研究中，刪除精氨酸和賴氨酸衍生肽Cath（3-20）與Cath（4-20）抑菌活性與母肽Cath（1-20）相比未降低。表明氨基端精氨酸和賴氨酸的存在對Cath（1-20）抑菌活性無改善作用，原因可能是衍生肽所帶正電荷（+5）對于抗菌肽Cath（1-20）發(fā)揮抑菌功能已提供足夠陽離子特性。

色氨酸（W）在天然抗菌肽中比例較高，對抗菌肽抑菌活性具有重要影響。作為一種芳香族氨基酸，色氨酸含芳香族側鏈結構可作用于脂質(zhì)雙層界面區(qū)域，將抗菌肽錨定于細菌質(zhì)膜上，使抗菌肽破壞細菌細胞膜結構[17,20]。通常色氨酸含量越高，抗菌肽抑菌活性越強。Pasupuleti等通過優(yōu)化天然抗菌肽的色氨酸含量與比例改善抗菌肽活性，或利用色氨酸設計全新抗菌肽分子[21-23]。本研究中，刪除氨基端色氨酸的衍生肽Cath（5-20）與未刪除該氨基酸殘基的母肽及另兩種衍生肽相比，抑菌活性未降低，但溶血活性及細胞毒性卻明顯降低。該結果表明，在鴨抗菌肽Cath（1-20）分子中色氨酸數(shù)量對其抗菌活性影響不大，該氨基酸是高溶血及細胞毒性關鍵因素。

破壞細胞膜是抗菌肽發(fā)揮抑菌作用重要機制之一[24]。本試驗研究抗菌肽Cath（1-20）及其衍生肽對細菌細胞膜作用機制。Cath（1-20）及其衍生肽可破壞細胞膜，快速提高ONPG在細菌胞內(nèi)濃度，使細胞膜快速去極化。透射電鏡結果也表明Cath（1-20）及Cath（5-20）使細菌細胞膜完整性受損，細胞內(nèi)容物釋放，殺死細菌。

本研究通過截短抗菌肽，刪除鴨抗菌肽Cath（1-20）氨基酸端氨基酸，獲得三種衍生肽Cath（5-20）、Cath（4-20）、Cath（3-20）。體外試驗表明，Cath（5-20）抑菌活性與母肽相當，但溶血及細胞毒性很低，可有效消除Cath（5-20）細胞毒副作用，保留抗菌活性，是一種富有開發(fā)潛力的新型抗菌肽分子。

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Design of derivatives of duck antimicrobial peptide Cathelicidin andantibacterial mechanism

FENG Xingjun,LIDan,ZHU Jian,LIU Chaoqun,GAO Wei,CHENHuixian
(School of Anim al Science and Technology,Nor theast Agricul tural University,Harbin 150030, China)

The duck antimicrobial peptide Cathelicidin [Cath(1-20)] contains a series of amino acidresidues with the characteristics of net positive charge and hydrophobicity. To screen novel derived peptidesof Cath(1-20) with ideal activity and investigated its antibacterial mechanism, truncated peptide derivatives ofCath(1- 20) were designed and synthesized by chemical method. The results showed that similar to theparent peptide Cath(1- 20), its three derivatives, Cath(5-20), Cath(4-20), Cath(3- 20), showed strongantimicrobial activity against a broad range of bacteria in vitro, with minimum inhibitory concentrations in therange of 1-8 μmol· L-1. However, only Cath(5-20) did not show obvious hemolytic activity and cytotoxicity. Thetherapeutic index of Cath(5-20) was 19.5, much higher than those of Cath(1-20), Cath(4-20) and Cath(3-20).Cath(1-20) and its derivatives were able to increase inner membrane permeability and depolarize the cellmembrane of E. coli UB1005 in a dose- and time-dependent manner. The result of transmission electronmicroscopy also showed that Cath(1-20) and Cath(5-20) could destroy bacterial cell membrane. This studydemonstrated that the tryptophan at the amino terminal played crucial role in the hemolysis and cytotoxicityof duck antimicrobial peptide Cath (1-20) and its main target was bacterial cell membrane.

antimicrobial peptides; duck; tryptophan; antibacterial activity; action mechanism

S852.2

A

1005-9369（2017）03-0040-08

時間2017-3-21 14:04:00[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170321.1404.024.htm l

馮興軍,李丹,朱健,等.鴨抗菌肽cathe licidin的衍生物設計及抑菌機制研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2017,48(3):40-47.

Feng Xing jun,Li Dan,Zhu Jian,et al.Design of derivatives of duck antim icrobial peptide Cathelicidin and antibacteria l mechanism[J].Journalof Northeast Agricultural University,2017,48(3):40-47.(in Chinese w ith English abstract)

2017-02-13

黑龍江省自然科學基金（C2016022）；東北農(nóng)業(yè)大學“學術骨干”項目（15XG15）

馮興軍（1978-），男，研究員，博士，碩士生導師，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學。E-mail：fengxingjun@neau.edu.cn