張志超 劉江紅 潘遠(yuǎn)安

深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518000

五指毛桃與黃芪提取物對免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫的影響

張志超 劉江紅 潘遠(yuǎn)安

深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院藥劑科，廣東 深圳 518000

目的：探討五指毛桃與黃芪提取物對免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫的影響。方法：取100只小鼠進(jìn)行研究，隨機(jī)分為正常對照組、陽性對照組(20mg/kg左旋咪唑)、五指毛桃提取物組、黃芪提取物組、環(huán)磷酰胺模型組，每組20只，經(jīng)腹部注射環(huán)磷酰胺制備免疫功能低下小鼠模型，經(jīng)連續(xù)灌胃給藥2周后，對各組小鼠的T淋巴細(xì)胞亞群變化、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、IL-1及INF-y進(jìn)行觀察。結(jié)果：黃芪提取物組與五指毛桃組的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)明顯高于環(huán)磷酰胺組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；黃芪提取物組與五指毛桃組的T細(xì)胞亞群數(shù)量及IL-1與INF-y含量顯著較環(huán)磷酰胺組高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：五指毛桃與黃其提取物均能提高免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能。

黃芪；五指毛桃；細(xì)胞免疫；免疫抑制

黃芪為常用補(bǔ)氣藥物，具有悠久的應(yīng)用歷史。黃芪單體具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[1]。五指毛桃被稱為南芪，其為常用的黃芪替代藥物。有學(xué)者認(rèn)為[2]，五指毛桃的補(bǔ)氣扶正作用與黃芪相近，適合南方人體質(zhì)。但是對于五指毛桃的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚無確切定論。本研究對免疫抑制小鼠分別應(yīng)用黃芪提取物與五指毛桃提取物，觀察其免疫指標(biāo)變化。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)動物 選擇健康昆明種小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22g。中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號SCXK(粵)2013-0001。

1.2 材料 黃芪與五指毛桃干燥藥材(深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院藥劑科提供)；環(huán)磷酰胺(國藥準(zhǔn)字H44020383，廣州白云山光華制藥股份有限公司)；鹽酸左旋咪唑片(國藥準(zhǔn)字H44020759，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；小鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1)、Hyclone改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、FT-TC-抗小鼠CD3、PE/Cy5-小鼠CD4、PE-抗小鼠CD8、II型干擾素(INF-y)ELISA試劑等試劑均購自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 AF2-0502-U超純水機(jī)(艾科浦公司)；Epics XL流式細(xì)胞儀(美國貝克曼COULTER公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)。

2 方法

2.1 藥物的制備 取黃芪與五指毛桃干燥藥材300g，以10倍量蒸餾水浸泡1.5h，加熱煮沸1.5h，濾取藥液；再加8倍量水，煮沸1h，第三次煮沸0.5h。合并三次濾物，將藥物濃縮為4g生藥/mL。

2.2 模型的制備與分組 100只小鼠隨機(jī)分為正常對照組、陽性對照組、環(huán)磷酰胺組、五指毛桃提取物組與黃芪提取物組，每組20只。除對照組外，每組均于腹部注射環(huán)磷酰胺，40～60mg/kg，連續(xù)1周，制備免疫抑制小鼠。五指毛桃組與黃芪組均給予中等且相同劑量，以4.4g/kg給小鼠灌胃，陽性對照組給予20mg/kg左旋咪唑，正常對照組給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)用藥2周。

2.3 評價指標(biāo)

2.3.1 脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù) 第14天給藥24h后，將所有小鼠摘眼球放血脫頸椎處死，稱量體重。取出脾臟與胸腺，采取4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，胸腺或脾臟質(zhì)量與小鼠體重之比作為胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)。

2.3.2 T淋巴細(xì)胞亞群比例測定 制備脾細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度1×107個/mL，100μL細(xì)胞混懸液+FTTC-抗小鼠CD3 1μL+PE/Cy5-小鼠CD4 1.25μL+PE-抗小鼠CD8 1.25μL。洗滌后離心，取沉淀細(xì)胞，加入500μLPBS，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行T細(xì)胞亞群數(shù)量檢測。

2.3.3 血清IL-1與INF-y含量測定 取各組小鼠眼眶靜脈血，靜置3h，使血清析出，以1500r/離心10min，取血清。根據(jù)試劑盒說明書對IL-1與INF-y含量進(jìn)行檢測。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計量資料以t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù) 黃芪提取物組與五指毛桃組的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)明顯高于環(huán)磷酰胺組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3.2 T細(xì)胞亞群比較 黃芪提取物組與五指毛桃組的T細(xì)胞亞群數(shù)量顯著較環(huán)磷酰胺組高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3.3 IL-1與INF-y含量比較 五指毛桃提取物組與黃芪提取物組的IL-1與INF-y含量均高于環(huán)磷酰胺組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 各組小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)比較±s)

注：與環(huán)磷酰胺組比較，*P<0.05。

表2 各組小鼠的T細(xì)胞亞群比較 ±s)

注：與環(huán)磷酰胺組比較，*P<0.05。

表3 各組小鼠的IL-1與INF-y水平比較

注：與環(huán)磷酰胺組比較，*P<0.05。

4 討論

免疫系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)外環(huán)境變化的適應(yīng)及反應(yīng)系統(tǒng)，與機(jī)體老化過程呈密切相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)[3]，免疫功能下降會加速機(jī)體衰老，衰老過程中，免疫功能會逐漸衰退，以細(xì)胞免疫功能下降最為明顯。因此，提高機(jī)體免疫功能，延緩人體衰老，成為許多學(xué)者研究的主要方向。

研究表明[4]免疫老化核心與淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、分泌功能下降、淋巴細(xì)胞凋亡異常等相關(guān)。而免疫細(xì)胞的細(xì)胞及分子水平具有可調(diào)控性，因此，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞活性、增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，重建衰老過程的淋巴細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)，可能成為延緩衰老的有效方法[5]。中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑、多器官調(diào)控免疫機(jī)制效果，將其作為免疫調(diào)節(jié)劑具有一定優(yōu)勢。黃芪是最常用的扶正補(bǔ)益中藥，經(jīng)藥理研究證實(shí)[6]，黃芪具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用。五指毛桃是華南地區(qū)常用藥物，其作用與黃芪相近。研究發(fā)現(xiàn)[7]，五指毛桃可通過提高機(jī)體抗氧化能力而產(chǎn)生抗衰老效果，也具有免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究通過對小鼠注射環(huán)磷酰胺制備免疫抑制小鼠，環(huán)磷酰胺是細(xì)胞毒性烷化劑，可抑制DNA合成，本研究除對照組外所有小鼠經(jīng)注射環(huán)磷酰胺后均造模成功。脾臟與胸腺為外周免疫器官，機(jī)體免疫分化與增值，均會對脾臟及胸腺質(zhì)量造成一定影響，通過胸腺與脾臟指數(shù)可判斷機(jī)體免疫狀態(tài)[8]。研究顯示，五指毛桃提取物組與黃芪提取物組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)明顯較環(huán)磷酰胺組高(P<0.05)，提示，五指毛桃與黃芪均有免疫增強(qiáng)作用，可保護(hù)免疫器官。

巨噬細(xì)胞可分泌IL-1，而IL-1以自分泌或旁分泌形式作用于巨噬細(xì)胞，參與固有免疫應(yīng)答過程[9]。對血清IL-1含量進(jìn)行檢測，可有效反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，五指毛桃提取物組與黃芪提取物組的IL-1水平明顯較環(huán)磷酰胺組高(P<0.05)，可見，五指毛桃與黃芪提取物能對巨噬細(xì)胞分泌功能產(chǎn)生影響，也能增強(qiáng)機(jī)體固有免疫應(yīng)答能力。

T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞包括CD4+與CD8+，其中CD4+可通過激活自身分泌趨化因子及細(xì)胞因子，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；CD8+可直接殺傷靶抗原，作用于腫瘤細(xì)胞與感染細(xì)胞，是機(jī)體早期免疫反應(yīng)細(xì)胞之一[10]。INF-y為Th1淋巴細(xì)胞亞群的細(xì)胞，可促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞增殖與分化，提高機(jī)體免疫功能。研究顯示，五指毛桃與黃芪提取物組的INF-y與CD8+、CD4+、CD4+/CD8+均高于環(huán)磷酰胺組(P<0.05)，表明五指毛桃與黃芪提取物可增強(qiáng)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量，從而恢復(fù)機(jī)體免疫平衡。

綜合上述，黃芪與五指毛桃提取物均可明顯提高小鼠免疫功能，但是對于五指毛桃是否在免疫調(diào)節(jié)方面能替代黃芪，尚需要更多研究進(jìn)一步探討。

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龍華新區(qū)科技計劃項(xiàng)目(NO：20160523A1030149)。

張志超(1980-)，男，漢族，本科，主管藥師，研究方向?yàn)樗帉W(xué)。 E-mail:390605928@qq.com

R285.5

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1007-8517(2017)05-0058-02

2016-12-22 編輯：程鵬飛)