閆文娟 賈亞玲 陳麗麗 何前松 馮 泳*

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州省銅仁市萬山區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科,貴州 銅仁 554200

小半夏加茯苓湯醇提物對(duì)BGC-823細(xì)胞線粒體凋亡通路的影響

閆文娟1賈亞玲2陳麗麗1何前松1馮 泳1*

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；2.貴州省銅仁市萬山區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科,貴州 銅仁 554200

目的: 觀察小半夏加茯苓湯醇提物對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823的凋亡作用以及誘導(dǎo)其凋亡發(fā)生的機(jī)制。方法:運(yùn)用MTT法檢測不同濃度的小半夏加茯苓湯醇提物對(duì)BGC-823的增殖抑制作用并計(jì)算抑制率；以羅丹明123為細(xì)胞染色劑，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體跨膜電位的改變；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Bax、Bcl-2和Cyt-c表達(dá)的變化。結(jié)果:MTT結(jié)果顯示小半夏加茯苓湯醇提物對(duì)BGC-823具有抑制作用，隨著給藥濃度的增加和作用時(shí)間的延長，抑制率逐漸升高，細(xì)胞活力逐漸減弱，與空白對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比，小半夏加茯苓湯醇提物能夠顯著降低線粒體跨膜電位(P<0.01)；qRT-PCR結(jié)果顯示，Bax基因表達(dá)顯著升高(P<0.01),Cyt-c基因表達(dá)升高(P<0.05)，Bcl-2基因的表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論:小半夏加茯苓湯醇提物可以抑制BGC-823細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并減小Bcl-2/Bax基因表達(dá)比例，增強(qiáng)Cyt-c基因表達(dá)，其機(jī)制可能與線粒體為核心的凋亡通路相關(guān)。

小半夏加茯苓湯；胃癌細(xì)胞BGC-823；凋亡；線粒體；

胃癌作為常見的消化道系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在中國排名第三[1]。胃癌的治療方法包括手術(shù)、放療、化療，但放化療引起的惡心、嘔吐、食欲不振等消化道反應(yīng)，如果未得到有效的控制，將降低胃癌患者的依從性及生存質(zhì)量而放棄治療。小半夏加茯苓湯(Xiao Banxia plus Fuling Decoction，XBFD)源于《金匱要略》，全方由半夏、生姜、茯苓組成，現(xiàn)代研究證實(shí)半夏、生姜、茯苓三味藥均有不同程度的抗腫瘤作用[3-5]。具有散飲降逆、和胃止嘔的作用，臨床上對(duì)于化療所致的遲發(fā)性嘔吐癥狀有明顯療效，較甲氧氯普安療效更好[2]。在辨證論治痰證腫瘤時(shí)亦常用到半夏、生姜、茯苓三味藥，為了進(jìn)一步明確小半夏加茯苓湯復(fù)方抗腫瘤的作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)以胃癌細(xì)胞BGC-823為對(duì)象，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time PCR，RT-qPCR)等方法，檢測線粒體跨膜電位(mitochondrialmembrane potential，MMP)以及相關(guān)基因表達(dá)的變化。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 人胃癌細(xì)胞BGC-823系購自上海細(xì)胞庫。小半夏加茯苓湯醇提物(取生半夏18g，茯苓9g，生姜15g，50%乙醇于85℃水浴鍋中提取，搖勻，干燥后稱取1.5g小半夏加茯苓湯醇提物干粉，用50mL 50%乙醇溶解，得30mg/mL母液，稀釋后使用[6])、高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗、磷酸鹽緩沖液均購自美國Hyclone公司、胎牛血清購自美國Gibco公司、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、羅丹明123(Rhodamine 123，Rh123)均購自美國Sigma公司、Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司、RNA提取試劑盒購自天根生化公司、Thermo ScientificMaxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 購自 Thermo Scientific公司、引物由上海生工公司合成。

1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermofisher，USA)、低溫高速離心機(jī)(Beckman Coulter，USA)、多功能酶標(biāo)儀(BioTek Synergy H4，USA)、流式細(xì)胞儀(BD，USA)、NanoDrop2000(Thermofisher，USA)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI ViiA7TMDx Fast，USA)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 BGC-823細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。將細(xì)胞分為小半夏加茯苓湯醇提物組(800μg/mL、700μg/mL、600μg/mL、500μg/mL、400μg/mL)，同時(shí)設(shè)不加藥物的完全培養(yǎng)液為空白對(duì)照組和乙醇溶劑對(duì)照組。分別檢測12、24h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞BGC-823以6×104/孔接種于96孔板，預(yù)先設(shè)定調(diào)零組、空白對(duì)照組、乙醇溶劑對(duì)照組和給藥組，給藥組分別加入不同濃度的XBFD醇提物，乙醇溶劑對(duì)照組加入與800μg/mL實(shí)驗(yàn)組等量的50%乙醇，每個(gè)組至少設(shè)三個(gè)平行孔。分別培養(yǎng)12h、24h后，每孔加入200μl 含濃度為5mg/mL MTT的培養(yǎng)液，37℃孵育4h后，棄液后加入DMSO 150μl，振蕩器充分振蕩后以490nm波長測定各孔吸光度(OD)，并記錄結(jié)果計(jì)算抑制率。抑制率=[1-(給藥組OD值-調(diào)零組OD值)/(空白組OD值-調(diào)零組OD值)]×100%。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)MMP的改變 取對(duì)數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,設(shè)實(shí)驗(yàn)組為終濃度600μg/mL的XBFD醇提物溶液，空白對(duì)照組加入與實(shí)驗(yàn)組等量的50%乙醇，相同的條件下分別培養(yǎng)12h，24h。收集上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3遍，收集洗滌液，按AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，并加入5μlRh123染色，常溫避光孵育10-30min后，上流式細(xì)胞儀檢測，每個(gè)樣本檢測10000個(gè)細(xì)胞，測定相對(duì)熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度的變化表示線粒體膜電位的變化。

2.4 qRT-PCR法檢測bax、Bcl-2和細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt-c) mRNA的相對(duì)表達(dá)量 收集并提取經(jīng)600μg/mL的XBFD醇提物處理24h后的BGC-823細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測量RNA純度及濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL：2μL cDNA模板，2×SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 10μL，水9μL，上下游引物各0.75μL。引物設(shè)計(jì)詳見表1。實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行,PCR反應(yīng)條件為：50℃2min，95℃10min，(95℃ 15sec，60℃ 30sec,92℃ 30sec)×40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，根據(jù)qRT-PCR檢測結(jié)果，分析得出各個(gè)樣品量的循環(huán)閾值(Ct)，以β-actin作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)設(shè)有 3 次重復(fù)，采用2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對(duì)定量分析。

表1 Real-timePCR 引物序列

3 結(jié)果

3.1 不同濃度XBFD醇提物對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的XBFD醇提物作用于胃癌細(xì)胞系BGC-823后，胃癌細(xì)胞增殖抑制率見表2，圖1。圖1顯示XBFD醇提物對(duì)BGC-823細(xì)胞活力的影響呈現(xiàn)“濃度-時(shí)間依賴性”的關(guān)系，即隨著給藥濃度的增加和作用時(shí)間的延長，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，細(xì)胞活力逐漸減弱，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

表2 不同濃度的XBFD醇提物對(duì)BGC-823的抑制作用

注：組間比較，*P<0.01；不同時(shí)段相比，#P<0.01

3.2 XBFD醇提物對(duì)BGC-823 MMP的影響 XBFD醇提物作用BGC-82312h、24h后，實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度顯著高于空白對(duì)照組(見表3，圖2)，提示MMP明顯降低，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.3 XBFD醇提物對(duì)BGC-823凋亡相關(guān)基因bax、Bcl-2和Cyt-c基因的影響 采用qRT-PCR方法，檢測600μg/mL的小半夏加茯苓醇提物干預(yù)BGC-823 24h后，細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2和Cyt-c基因相對(duì)表達(dá)量的變化。Bax基因檢測結(jié)果表明與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中Bax基因相對(duì)表達(dá)量變化明顯升高(P<0.01)，Cyt-c基因相對(duì)表達(dá)量變化升高(P<0.05)；Bcl-2相對(duì)表達(dá)量變化降低(P<0.05)(見表4)。

表3 XBFD醇提物對(duì)BGC-823熒光強(qiáng)度的影響

注：與同時(shí)段空白對(duì)照組相比，*P<0.01。

表4 XBFD醇提物對(duì)BGC-823凋亡基因表達(dá)的影響

注：同一基因與空白對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為胃癌屬于“胃反”、“噎嗝”、“胃脘痛”、“積聚”、“伏梁”等癥的范疇，其病機(jī)與脾胃虛弱、痰濁阻滯有關(guān)[7]。痰飲與腫瘤關(guān)系密切[8]，諸多醫(yī)家提倡腫瘤當(dāng)“從痰飲論治”[9]，“當(dāng)以溫藥和之”[10]。痰飲的治療大法首載于《金匱要略》，并用小半夏加茯苓湯作為治療痰飲的名方。小半夏加茯苓湯用于臨床的止嘔研究較多，但對(duì)抗腫瘤作用機(jī)理的研究較少。本課題組前期研究表明，該復(fù)方對(duì)于腫瘤細(xì)胞有促凋亡和提高機(jī)體免疫力的作用。楊長福等[11]發(fā)現(xiàn)小半夏加茯苓湯可抑制HepG2細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡，機(jī)制可能通過激活caspase-3蛋白表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期于S期，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。何前松等[12]發(fā)現(xiàn)小半夏加茯苓顆粒含藥血清可下調(diào)SGC-7901細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá),抑制細(xì)胞生長增殖,其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞毒作用有關(guān)。蔡琨等[13]發(fā)現(xiàn)小半夏加茯苓顆?？稍鰪?qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能，抑制模型鼠腫瘤的生長，具有一定的腫瘤抑制及免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)以BGC-823為研究對(duì)象，采用小半夏加茯苓湯醇提物用于體外實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小半夏加茯苓湯醇提物對(duì)BGC-823細(xì)胞具有增殖抑制作用，并且呈現(xiàn)出明顯的量效時(shí)效關(guān)系。

細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括內(nèi)源途徑(又稱線粒體凋亡途徑)、外源途徑(又稱死亡受體凋亡途徑)以及非依賴caspase凋亡途徑[14]。在細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后，線粒體膜電位降低可以使線粒體內(nèi)釋放一系列凋亡因子可引起如Cyt-c和Apaf-1等到細(xì)胞質(zhì)中, 激活下游的caspase家族, 促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。本實(shí)驗(yàn)選擇羅丹明123染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體跨膜電位。Rh123是一種可透過細(xì)胞膜的陽離子熒光染料，在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱或消失，而在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體膜完整性被破壞，引起線粒體跨膜電位的崩潰，Rh123重新釋放出線粒體，從而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光[16]。FCM結(jié)果顯示，給藥組細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，提示XBFD醇提物能夠降低線粒體跨膜電位，說明XBFD醇提物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡其中途徑之一可能與損傷腫瘤細(xì)胞的線粒體相關(guān)。

Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的重要因子，與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)[17]。正常情況下Bax是以單體形式存在于線粒體膜上，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)時(shí)，Bax能自身形成同源二聚體(Bax/Bax)促進(jìn)Cyt-c的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。Bcl-2位于線粒體外膜，Bcl-2可以與Bax形成異源二聚體(Bcl-2/Bax)以抑制細(xì)胞凋亡。因此Bcl-2/Bax比例是決定細(xì)胞凋亡與否的關(guān)鍵因素。當(dāng)Bcl-2/Bax值降低時(shí)，細(xì)胞凋亡趨勢增加[19]。本實(shí)驗(yàn)中促凋亡基因Bax在小半夏加茯苓湯誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞BGC-823中的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比例減小，使線粒體膜電位降低，通透性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子和Cyt-c被大量釋放到胞質(zhì)中，導(dǎo)致BGC-823細(xì)胞啟動(dòng)線粒體途徑發(fā)生凋亡。

因此，小半夏加茯苓湯對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞有生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用,其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制可能與線粒體損傷同時(shí)伴隨下調(diào)Bcl-2/Bax比例，促進(jìn)Cyt-c大量釋放有關(guān)。但細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過程，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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The Effects of the Xiaobanxia Plus Fuling Ethanol Extract on Mitochondrial ApoptoticPathway in BGC-823 Cells

YAN Wenjuan1JIA Yaling2CHEN Lili1HE Qiansong3FENG Yong1*

1.GuiYang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang Guizhou 550002, China；2.Department of Traditional Chinese Medicine Wanshan District People's Hospital, Tongren Guizhou 554200, China

Objective To observe the effect of Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract on gastric cancer cell BGC-823 apoptosis and its mechanism induced apoptosis.Methods MTT was used to detect different concentrations of Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract on proliferation of BGC-823 inhibition and calculate the inhibition rate ; Rhodamine 123 cell stain, Flow Cytometry was used to detect changes of mitochondrial membrane potential; Real-time PCR to detect Bax, Bcl-2 and Cyt-c the change of expression.Results MTT results showed that Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract has an inhibitory effect on BGC-823, with the increase of drug concentration and action time, the inhibition rate increased gradually,the cell viability decreased, there wassignificant differencecompared with the control group (P<0.01).Flow Cytometryresults showed that, compared with the control group, Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract cansignificantlyreduce the mitochondrial membrane potential(P<0.01); qRT-PCR results showed that baxgeneexpressionincreased significantly,Cyt-c gene expressionincreased, the Bcl-2 gene decreased (P<0.05).Conclusion Xiao Banxia Plus Fuling Ethanol Extract could reduce the BGC-823 cells viability, induce apoptosis and down-regulate the proportion of gene expression of Bcl-2, Bax in BGC-823 cells, Enhance Cyt-c gene expression.The mechanism may be related to the mitochondrial apoptotic pathway.

Xiaobanxia Plus Fuling Ethanol Extract; Gastric Cancer Cell BGC-823; Apoptosis; Mitochondria

國家自然科學(xué)基金(No.81160425/H2705)。

閆文娟(1989-)，女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴帍?fù)方配伍。E-mail:303497591@qq.com

馮泳(1964-)，女，漢族，教授，研究方向?yàn)橹兴帍?fù)方配伍研究。E-mail:fy668@sina.com

R285.5

A

1007-8517(2017)05-0042-04

2016-12-23 編輯：程鵬飛)