趙會勤 李超杰 徐玉潔 賈 奧 賈貝西* 賈成軍

1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

實驗研究

瑤藥崗松抗佐劑性大鼠關(guān)節(jié)炎的實驗研究

趙會勤1李超杰1徐玉潔1賈 奧1賈貝西1*賈成軍2

1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

目的：觀察瑤藥崗松根醇提物(BFTE)對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的藥理作用。方法：42只大鼠隨機分為正常組、模型組、雷公藤多苷組及BFTE高、中、低劑量組，完全弗氏佐劑誘導(dǎo)AA后，于第12天開始連續(xù)灌胃給藥16d；同一時間點測定大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎評分、免疫器官指數(shù)；第29天處死大鼠，酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量，光學(xué)顯微鏡觀察大鼠踝關(guān)節(jié)的病理變化。結(jié)果：與模型組相比，BFTE能夠顯著抑制AA大鼠的原發(fā)性和繼發(fā)性足跖腫脹度，降低關(guān)節(jié)炎評分、免疫器官系數(shù)，改善大鼠踝關(guān)節(jié)病理狀態(tài)，下調(diào)AA大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。結(jié)論：BFTE對AA大鼠具有良好的治療作用，其抗炎免疫的機理可能與減少TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌有關(guān)。

瑤藥；崗松；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；佐劑性關(guān)節(jié)炎；炎癥因子

桃金娘科植物崗松(BaeckeafrutescensL.)為廣西瑤族民間習(xí)用藥材，盤瑤語稱“樸老中”，產(chǎn)于我國的南部地區(qū)，全株均可入藥，具有化瘀止痛、清熱解毒、利尿通淋、殺蟲止癢的功效，臨床用于感冒高熱、黃疸型肝炎、胃痛、腸炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、腳氣病、膀胱炎、小便不利等[1-2]。目前，崗松資源的開發(fā)利用僅以地上部分(枝葉)所含揮發(fā)油為主，而對地下部分(根)的研究報道較少。課題組對崗松根進行了較為系統(tǒng)的化學(xué)研究，分離鑒定Baeckeins A-I共9個新化合物[3-6]，并進行初步的抗炎活性評價。本研究在前期基礎(chǔ)上，結(jié)合民間用藥習(xí)慣及文獻資料記載，擬對崗松根醇提物抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的藥理作用開展研究，并在細胞水平探討其可能的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 SD大鼠，雄性，體重180～220 g，購自購自河南省實驗動物中心，動物合格證號：SYXK(豫)2011-0001。

1.2 藥品與試劑 瑤藥崗松采自廣西南寧，經(jīng)廣西民族醫(yī)藥研究院戴彬主任醫(yī)師鑒定為BaeckeafrutescensL.的根，經(jīng)95%乙醇提取、回收溶劑得總浸膏(BFTE)，使用時用0.5% CMC-Na溶液的配制成所需濃度。雷公藤多苷片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司)；完全弗氏佐劑(CFA，美國Sigma公司)；TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA 試劑盒和IL-1β ELISA 試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)；甲醛(天津市風(fēng)船試劑科技有限公司)。

1.3 儀器 電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；外徑千分尺(Radio Shack Corporation)；離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；全自動酶標(biāo)儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 AA大鼠模型的制備及分組給藥 從4 ℃冰箱中取出CFA，充分振蕩、混勻；將大鼠右后肢拉直，用75%的酒精消毒，使用l mL注射器于大鼠足跖皮內(nèi)注射0.15 mL CFA致炎，正常對照組大鼠注射等體積的生理鹽水[7-9]。將42只大鼠隨機分為正常組、模型組、雷公藤多苷組、崗松根醇提物高(BFTE-H)、中(BFTE-M)、低(BFTE-L)劑量組，每組7只；于造模后第12天開始灌胃給藥，連續(xù)給藥16 d；雷公藤多苷組給予雷公藤多苷10 mg/kg，BFTE-H、BFTE-M、BFTE-L組分別給予BFTE 6.0、3.0、1.5 g生藥/kg/d，正常組及模型組給予等量的0.5% CMC-Na溶液。

2.2 足趾腫脹度 于造模前及造模后12、24、36、48h用電子游標(biāo)卡尺測量大鼠右后足跖厚度，以致炎前后的差值作為大鼠的足趾腫脹度(即足趾腫脹度=致炎后足趾厚度-致炎前足趾厚度)[10-11]，以后每4 d測量一次(即4、8、12、16、20、24、28d)，觀察AA大鼠原發(fā)性和繼發(fā)性足跖腫脹。

2.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù) 大鼠炎癥出現(xiàn)后，每隔4d觀察并記錄病變程度。病變程度按5級評分法評價：0分-無紅腫，1分-關(guān)節(jié)有紅色斑點或輕度腫脹，2分-關(guān)節(jié)中度紅腫，3分-關(guān)節(jié)重度紅腫，4分-關(guān)節(jié)嚴重腫脹并伴有功能障礙；累計大鼠各個關(guān)節(jié)的評分和即為關(guān)節(jié)炎指數(shù)，每只大鼠最多評16分[12]。

2.4 細胞因子 大鼠繼續(xù)給藥至28d，禁食但不禁水12 h，于第29天稱量各組大鼠的體重，用20%烏拉坦(20g/100 mL)腹腔注射麻醉(0.6mL/100g)，腹主動脈取血，凝血后離心分離血清，按照試劑盒說明，采用ELISA法分別測定TNF-α、IL-6、IL-1β的含量[13]。

2.5 免疫器官系數(shù) 于第29d大鼠取血后，摘除胸腺和脾，用生理鹽水沖洗后，用濾紙吸除多余的水分，電子天平稱重，計算胸腺和脾臟指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體重(g))[14]。

2.6 病理切片 第29天處死各組大鼠，取下包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的整個右足爪，置于4%多聚甲醛中固定48 h后，使用10%EDTA脫鈣完全后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)[15]，在高倍顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)的病理變化。

3 結(jié)果與討論

3.1 BFTE對AA大鼠原發(fā)性足趾腫脹的影響 與正常組相比，各組大鼠右側(cè)足跖腫脹明顯(P< 0.01)，除正常組以外的其它各組間大鼠足跖腫脹無統(tǒng)計學(xué)差異，顯示造模成功(見表1)。于造模第12天開始灌胃給藥，雷公藤多苷組、BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L組在給藥12d和16d(即造模24d和28d)后能有效減輕大鼠原發(fā)足跖腫脹程度；造模28d時，與模型組相比，雷公藤多苷組、BFTE-H和BFTE-L組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，BFTE-M組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；與雷公藤多苷組相比，BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而BFTE各劑量組間也無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。由此可見，BFTE能夠顯著降低AA大鼠原發(fā)性足趾腫脹，BFTE-M組效果最好。

表1給藥前AA大鼠的原發(fā)性足跖腫脹度 ±s，n=7)

注：與正常組比較，##P<0.01。

表2 給藥后AA大鼠的原發(fā)性足跖腫脹度 ±s，n=7)

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 BFTE對AA大鼠繼發(fā)性足趾腫脹的影響 除正常組外的各組大鼠，于造模后第12天出現(xiàn)繼發(fā)性左后足跖腫脹，第16天達到高峰。與正常組相比，第12天開始各組大鼠均出現(xiàn)明顯的足跖腫脹(P<0.05)；給藥12d(即造模24d)后，雷公藤多苷組和BFTE各劑量組能夠顯著降低AA大鼠繼發(fā)性足趾腫脹程度(P<0.05)；給藥16d(即造模28d)后，各給藥組大鼠繼發(fā)性足趾腫脹程度繼續(xù)降低，與模型組相比，均具有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；與雷公藤多苷組相比，BFTE各劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而BFTE各組間也無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。表明BFTE對AA大鼠繼發(fā)性足趾腫脹具有顯著的抑制作用，且BFTE-M組作用最強。見表3。

表3 AA大鼠的繼發(fā)性足跖腫脹度

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 BFTE對AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 模型組大鼠于造模12h后原發(fā)側(cè)足跖急速腫脹，關(guān)節(jié)炎指數(shù)升至3左右；8d后腫脹向膝關(guān)節(jié)蔓延，關(guān)節(jié)炎指數(shù)升至4左右；12d繼發(fā)側(cè)足跖開始出現(xiàn)腫脹，且大鼠前趾也開始出現(xiàn)紅腫，關(guān)節(jié)炎指數(shù)有大幅度提升；隨病程延長，關(guān)節(jié)炎指數(shù)持續(xù)升高，24d達到高峰。20d時各給藥組大鼠的原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)足跖腫脹開始降低，前爪足趾紅腫也有所減輕；28d時，與模型組相比，雷公藤多苷組、BFTE-H、BFTE-M和BFTE-L組具有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，而與雷公藤多苷組相比，BFTE各劑量組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明BFTE能顯著改善AA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀。見表4。

表4 各組大鼠的關(guān)節(jié)炎評分情況 ±s，n=7)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 BFTE對AA大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，BFTE各劑量組對AA大鼠血清中的IL-1β和IL-6均具有極顯著的抑制作用(P<0.01)，BFTE-M和BFTE-L組對TNF-α也具有顯著作用(P<0.05)；與雷公藤多苷組相比，BFTE-H和BFTE-M組對大鼠血清中IL-1β的抑制作用顯著(P<0.05)(見表5)。由此可見，BFTE在降低AA大鼠血清中的IL-1β方面更為突出，其作用優(yōu)于陽性藥雷公藤多苷，且量效關(guān)系明顯。

表5 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與雷公藤多苷組相比較，%P<0.05，%%P<0.01。

3.5 BFTE對AA大鼠免疫器官系數(shù)的影響 與正常組相比，模型組大鼠的脾系數(shù)和胸腺系數(shù)均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，BFTE-M和BFTE-L組的脾系數(shù)和胸腺系數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而BFTE-H組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；與雷公藤多苷組相比，BFTE各劑量組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。表明BFTE對AA大鼠免疫器官具有保護作用，但BFTE-L組效果較好。見表6。

表6 各組大鼠的免疫器官指數(shù)

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.6 BFTE對AA大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化的影響 大鼠踝關(guān)節(jié)病理檢查顯示：正常組大鼠滑膜上皮規(guī)整、單層排列，軟骨光滑清晰，關(guān)節(jié)腔內(nèi)清晰、無炎性細胞浸潤；模型組大鼠滑膜有組織增生和炎性細胞的滋潤，且軟骨有一定的剝落；給予雷公藤多苷或不同劑量的BFTE治療后，大鼠的滑膜組織增生、軟骨破壞及炎性細胞浸潤均有不同程度的減輕。見圖1。

4 討論

佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠是一種免疫性炎癥模型，是篩選和評價抗風(fēng)濕藥常用的模型之一，其發(fā)病機制和病理表現(xiàn)與人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類似；該模型造模簡單易行、周期短、重復(fù)性好，被認為是研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最為理想的模型之一。研究表明，炎性細胞因子在RA發(fā)病過程中起重要作用，尤其是參與炎癥的全過程，加重炎性反應(yīng)；TNF-α與IL-1β是促炎性細胞因子，常同時合成分泌，被稱為姊妹細胞因子；TNF-α刺激IL-6和IL-1β的釋放，致使炎癥反應(yīng)加重，并且能促進滑膜及內(nèi)皮細胞成纖維細胞因子的產(chǎn)生，破壞滑膜細胞和軟骨細胞，引起滑膜增生、軟骨的破壞；IL-1β誘導(dǎo)TNF-α和IL-6的表達，促進滑膜細胞、軟骨細胞的增值，致使關(guān)節(jié)損壞；IL-6不僅增強 IL-1β和TNF-α的效應(yīng)，還能促進類風(fēng)濕因子的合成。

本研究基于AA大鼠模型，對瑤藥崗松根的醇提物進行抗風(fēng)濕活性評價，結(jié)果表明，崗松根能夠顯著減輕AA大鼠的原發(fā)性和繼發(fā)性足趾腫脹度，降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)、保護免疫器官，改善大鼠踝關(guān)節(jié)的病理狀態(tài)，下調(diào)AA大鼠血清中炎癥因子水平，顯示出良好的抗炎免疫作用，并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，其作用機制可能調(diào)節(jié)機體免疫功能、減少IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌；本研究通過整體動物實驗驗證了崗松根的抗風(fēng)濕效用，該研究可為瑤藥崗松的資源開發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

[1]盧文杰，劉布鳴，牙啟康，等.中藥崗松的研究概況[J].廣西醫(yī)學(xué)，2008，30(10)：1517-1519.

[2]國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:625-626.

[3]Jia BX，Yang J，Chen XQ，et al.Baeckeins A and B, two novel 6-Methylflavonoids from the roots of Baeckeafrutescens[J].HelvChimActa，2011，94(12)：2283-2288.

[4]Jia BX，Zhou YX，Chen XQ，et al.Structure determination of baeckeins C and D from the roots of Baeckeafrutescens[J].MagnResonChem，2011，49(11)：757-761.

[5]Jia BX，Ren FX，Jia L，et al.Baeckein E, a new bioactive C-methylated biflavonoid from the roots of Baeckeafrutescens[J].Nat Prod Res，2013，27(22)：2069-2075.

[6]JiaBX，ZengXL，RenFX，et al.Baeckeins F-I, four novel C-methylated biflavonoids from the roots of Baeckeafrutescensand their anti-inflammatory activities[J].Food Chem，2014，155：31-37.

[7]張雯，貢磊，周玲玲，等.不同比例甘草配伍祖師麻抗大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎的實驗研究[J].中草藥，2014，45(10)：1418-1426.

[8]國林，黃海瀟，謝玲，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32(2)：121-123.

[9]闞晶，李俊，馮利杰.苦參素對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用[J].安徽醫(yī)藥，2011，15(11)：1348-1351.

[10]張薇，李濤，李萍，等.祛風(fēng)止痛膠囊對關(guān)節(jié)炎模型大鼠抗炎作用及機制的實驗研究[J].中國骨傷，2009，22(11)：848-851.

[11]楊艷麗，陳超.香椿子總多酚對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29(12)：1073-1077.

[12]盧振華，廖矛川，王麗君，等.江南牡丹草總生物堿對大白鼠佐劑關(guān)節(jié)炎繼發(fā)腫脹及血沉升高治療作用的實驗研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2010，18(11)：4-6.

[13]趙春穎，劉永平，馬帥，等.赤雹根總皂苷對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血清及足TNF-α,IL-1β,IL-6水平的影響[J].中藥藥理與臨床，2015，31(2)：34-38.

[14]孫響波.馬錢子配伍蘇木對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫作用機理的研究[D].濟南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[15] 李歸浦.厚殼貽貝脂溶性提取物的制備和抗關(guān)節(jié)炎效果及其作用機理研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2011.

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Experimental Study on Anti-adjuvant Arthritis in Rats of Baeckeafrutescens

ZHAO Huiqin1LI Chaojie1XU Yujie1JIA Ao1JIA Beixi1*JIA Chengjun2

1.College of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China；2.Henan Province Hospital of TCM, Zhengzhou 450002, China

Objective To investigatethe pharmacological effects of Baeckea frutescens on adjuvant arthritis (AA) rats.Methods The 42 rats were randomly divided into six groups, including normal group, model group, positive control group (tripterygium glycosides), and high/medium/low dose groups oftotal extract of B.frutescens (BFTE).The complete Freund's adjuvant (CFA)-induced AA rats were used as model.After modeling, the intragastric administration began on the 12th day and last for 16 days, and the articular swelling, arthritis score, and immune organ index were measured during this time.The rats were sacrificed on the 29th day, and the inflammatory factors of TNF-α, IL-6, and IL-1β in the serum were detected by ELISA, and the pathological sections for ankle joints were made by hematoxylin-eosin (HE) staining.Results Compared with the model group, the BFTE could significantly inhibit the primary and secondary articular swelling, lower the arthritis score and immune organ index, improve the ankle pathologies, and reduce the serum levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β.Conclusion The roots of B.frutescens showed significant therapeutic effect on AA rats, and the anti-inflammatory immunemechanism may be related to decreasing the secretion of TNF-α, IL-6, and IL-1β.

Yao Medicine; Baeckea Frutescens; Rheumatoid Arthritis; Adjuvant Arthritis; Inflammatory Cytokines

國家自然科學(xué)基金(NO.：81303162)；中國博士后科學(xué)基金(NO.：2015T80784、2014M552017)；河南省博士后科研資助(NO.：2013010)。

趙會勤(1990-)，女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為中藥活性成分及質(zhì)量評價。E-mail:1320581532@qq.com

賈貝西(1982-)，女，漢族，博士，講師，研究方向為中藥活性成分及質(zhì)量評價。E-mail：jiabeixi_2003_123@163.com

R282.7

A

1007-8517(2017)05-0037-05

2017-01-03 編輯：程鵬飛)