許 慶 安艷蘇 肖植國

云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

HPLC法測定歸芍舒肝散中芍藥苷的含量

許 慶 安艷蘇 肖植國

云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

目的：建立高效液相色譜法測定歸芍舒肝散中芍藥苷的含量。方法：采用BDS HYPERSIL C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇-0.1%磷酸溶液(26∶74)為流動相，流速為1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：230nm。結果：芍藥苷濃度在5.21～104.11μg范圍內與峰面積呈良好線性關系，r=0.9999，平均回收率為98.94%(RSD為1.2%)。結論：本方法準確、快速、簡便可靠，結果穩(wěn)定，可用于歸芍舒肝散中芍藥苷的含量測定。

歸芍舒肝散；芍藥苷；高效液相色譜法

歸芍舒肝散是曲靖市中醫(yī)醫(yī)院的院內制劑，由白芍、當歸、柴胡、白術、茯苓、薄荷、甘草(炙)等七味中藥組成，具有疏肝健脾、養(yǎng)血調經的作用。臨床用于肝氣不舒，胸脅脹痛，頭暈目眩，食欲減退，月經不調等癥。制劑中白芍為君藥，具有養(yǎng)血調經、柔肝止痛之功效[1-2]。白芍的主要有效成分為芍藥苷，是一種單萜類糖苷化合物，藥理研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有抗自由基損傷，抑制細胞內鈣超載和抗神經毒性等活性，體內實驗證明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴張血管、改善微循環(huán)、抗氧化、抗驚厥等多種生物學效應[3-6]。由于不同產地來源、不同炮制方法的白芍中芍藥苷含量會有顯著差異[7-8]，而歸芍舒肝散現(xiàn)行質量標準中僅以顯微及薄層色譜來鑒別其中部分藥材，未建立制劑中白芍含量測定方法。本文參照文獻[9-12]，以芍藥苷為定量控制指標，采用高效液相色譜法(HPLC)對芍藥苷進行含量測定，為有效控制歸芍舒肝散質量提供了可靠且簡便易行的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀(包括G1322A系列四元泵，G1315D DAD檢測器，G1316A柱溫箱，G1329A自動進樣器)；KQ-300UDB型雙頻數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLE MS205DU電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；PURELAB Flex 3一體式超純水儀(英國ELGA公司)。

1.2 材料 芍藥苷對照品(批號：110736-201539，中國食品藥品檢定研究院)；磷酸(分析純，批號：2015071401，成都市科龍化工試劑廠)，甲醇(色譜純，CAS號：67-56-1，賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，水為純化水。歸芍舒肝散(批號：140203、150309、160103，曲靖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室)。陰性樣品用藥材當歸、柴胡、白術、茯苓、薄荷、甘草(炙)來源于曲靖市食品藥品檢驗檢測中心中藥標本室經檢驗合格的留樣標本。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：BDS HYPERSIL C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(26∶74)；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：230nm；進樣量：10μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品內容物，混勻，取約0.2g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲(頻率：45KHz；功率：240W)30min，取出，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備液的制備 精密稱取芍藥苷對照品11.25mg置25mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，即得芍藥苷質量濃度為0.4338mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按歸芍舒肝散處方比例，分別稱取除白芍外的其它藥材，依歸芍舒肝散工藝制備不含白芍的陰性樣品，并按“2.2.1”項下制備陰性樣品溶液。

2.3 線性關系的考察 分別精密吸取“2.2.2”項下芍藥苷對照品溶液0.3、0.6、1.2、3.0、6.0mL，分別置25mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得含芍藥苷5.21、10.41、20.82、52.06、104.11ug/mL的系列對照品溶液。在“2.1”項下色譜條件進樣分析，以對照品濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，計算線性回歸方程，得芍藥苷的回歸方程Y=12.8698X-3.1886(r=0.9999)。結果表明，芍藥苷濃度在5.21～104.11μg范圍內具有良好線性關系。

2.4 精密度試驗 精密吸取同一芍藥苷對照品溶液(含芍藥苷52.06μg/mL)在“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積值，RSD為0.7%，表明儀器的精密度良好。

2.5 重復性試驗 取同一批歸芍舒肝散(批號160103)6份，按“2.2.1”項下的方法處理，記錄峰面積，計算含量，結果，每1g樣品中平均含芍藥苷5.385mg，RSD為1.1%，表明本方法的重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(批號160103)，分別于0、2、4、8、12、24h按“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積。結果芍藥苷的RSD為1.3%。表明供試品溶液在24h內質量穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 分別取已知含量的同一批歸芍舒肝散(批號160103)約0.1g，精密稱定，共6份，分別精密加入對照品溶液(濃度為0.4338mg/mL)1mL，按“2.2.1”項下的方法處理，制備供試液，分別測定，計算回收率。平均回收率為98.94%，RSD為1.2%。見表1。

2.8 專屬性試驗 將陰性樣品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，見圖1。結果色譜圖中在芍藥苷相應出峰位置未出現(xiàn)干擾峰。

表1 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.9 樣品含量測定 取不同批號的供試品3批按“2.2.1”項下的方法處理，制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，按上述色譜條件測定峰面積積分值，以外標法計算芍藥苷含量。見表2。

表2 樣品含量測定結果 (mg/g,n=3)

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗先后試用文獻中[3,9-12]乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-1%醋酸溶液及乙腈-甲醇-0.2%磷酸多個組合的流動相，其中乙腈-0.1%磷酸及甲醇-0.1%磷酸為流動相時樣品中芍藥苷均能得到很好地分離，但考慮到勞動保護和分析成本，實驗采取了甲醇-0.1%磷酸(26∶74)為流動相。結果能得到對稱性較好的芍藥苷峰，并且樣品中芍藥苷與其它雜質能很好地分離，故選用甲醇-0.1%磷酸(26∶74)為流動相。

3.2 提取條件的選擇 試驗中曾比較了70%甲醇水浴回流提取和超聲提取,結果回流提取雜質較多，過程繁瑣；超聲提取雜質較少，簡便快速。且加標回收率較好，故選用超聲提取。精密稱取樣品(批號160103)5份,每份約0.2g，精密加入70%甲醇25mL,分別超聲(頻率：45KHz;功率：240W)處理10、20、25、30、40min,結果超聲25min后,芍藥苷含量基本不變，證明樣品超聲處理30min后，能將樣品中的芍藥苷提取完全，所以超聲(頻率：45KHz;功率：240W)時間確定為30min。

綜上，本方法準確、快速、簡便可靠，結果穩(wěn)定，可用于歸芍舒肝散中芍藥苷的含量測定。

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Determination of Paeoniflorin in Guishao Shugan Powder Content with HPLC Method

XU Qing AN Yansu XIAO Zhiguo

Yunnan Qujing City Food and Drug Inspection Test Center, Qujing 655000，China

Objective To establish a reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) determination of paeoniflorin in Guishao Shugan powder.Methods HYPERSIL C18BDS chromatographic column (250mm×4.6mm, 5um) was used to methanol -0.1% phosphoric acid solution (26∶74) as mobile phase, flow rate was 1.0mL/min; column temperature: 30 degrees C; detection wavelength: 230nm.Results The concentration ofr=0.9999 in the range of 5.21 ～ 104.11ug/mL was good linear relationship with the peak area, and the average recovery rate was 98.94% (RSD1.2%).Conclusion The method is accurate, rapid, simple and reliable, stable, and can be used for content determination of paeoniflorin in Guishao Shugan powder.

Guishao Shugan Powder; Paeoniflorin; HPLC

許慶，男，漢族，本科，主管藥師，研究方向為食品藥品檢驗。E-mail:114204205@qq.com

R248

A

1007-8517(2017)05-0032-03

2016-12-17 編輯：穆麗華)