馮宏玲 黃 森 李穆睿 張 慧 * 于思慧 韓 麗

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.遼寧省藥械審評與監(jiān)測中心，遼寧 沈陽 110030

雙黃連口服液化學(xué)成分含量測定及指紋圖譜研究

馮宏玲1黃 森2李穆睿1張 慧1*于思慧1韓 麗1

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.遼寧省藥械審評與監(jiān)測中心，遼寧 沈陽 110030

目的：測定雙黃連口服液化學(xué)成分含量，建立化學(xué)成分指紋圖譜的研究，為雙黃連口服液質(zhì)量標準研究提供理論依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法，Agilent C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇(A)-0.25%冰乙酸(B)，流速為1.0mL/min；柱溫為30℃；進樣體積為10μL。結(jié)果：測定雙黃連口服液中化學(xué)成分含量并建立了指紋圖譜，標定12個共有峰，以9號峰(即黃芩苷)為參照。方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于3.0%。結(jié)論：建立了以黃芩苷、連翹苷和綠原酸為參照物，測定不同廠家的雙黃連口服液的含量及化學(xué)指紋圖譜方法，結(jié)果顯示不同廠家制劑的指紋圖譜存在差異性，此方法簡便，重現(xiàn)性好，精密度高，可以為雙黃連口服液質(zhì)量標準提供一定的依據(jù)。

雙黃連口服液；高效液相色譜法；含量測定；指紋圖譜

雙黃連口服液是臨床抗菌抗病毒常用藥，由金銀花、黃芩和連翹三味中藥提取精制而成，具有抑菌[1]、抗病毒[2-3]、解熱抗炎[4]的作用，用于治療外感風熱所致的感冒，癥見發(fā)熱頭痛、咳嗽及咽痛等。此三味中藥主要成分為綠原酸、黃芩苷以及連翹苷，綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[5]，黃芩苷具有抗菌抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛抗炎、清除氧自由基等作用[6]，連翹苷具有抗菌抗病毒、抗炎、保肝等作用[7]，這三種化合物是雙黃連口服液中主要活性及藥效成分。目前用高效液相色譜法來測定雙黃連口服液中的有效成分是主要的檢測方式[8-10]，且指紋圖譜是國內(nèi)外公認的鑒別中藥品種和評價中藥質(zhì)量的非常有效的手段。因此有必要對不同廠家及批次的制劑中這三種成分的含量及指紋圖譜進行研究，為此建立了本文的研究方案，可能會對控制藥品質(zhì)量、保證人民用藥的安全有效起到積極的作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(包括四元泵，DAD 檢測器，柱溫箱，工作站，安捷倫科技有限公司)；AR2140型電子分析天平(上海奧豪斯公司)；METTLER AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士)；超聲提取儀(240W，50-60Hz，上海必能超聲儀器公司)。

1.2 材料 連翹苷(批號：110821-201213)、綠原酸(批號：110753-201314)、黃芩苷(批號：110715-201117)等對照品購自中國食品藥品檢定研究院。純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，甲醇等試劑均為色譜純。藥品見表1。

表1 11批雙黃連口服液

2 化學(xué)成分含量測定

雙黃連口服液是由金銀花、黃芩、連翹三種藥材制成的中藥制劑，金銀花中有效成分主要為綠原酸、黃芩中有效成分主要為黃芩苷、連翹中有效成分主要為連翹苷，中國藥典也以這三種成分作為指標性成分[11]，以3種成分為指標，建立了雙黃連口服液的含量測定方法。

2.1 色譜條件 梯度洗脫：0～8min，A(15%～30%)-B(85%～70%)；8～15min，A(30%～35%)-B(70%～65%)；15～20min，A(35%～53%)-B(65%～47%)；20～45min，A(53%～63%)-B(47%～37%)；45～65min，A(63%～100%)-B(37%～0%)；檢測波長：280nm。

2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取綠原酸、連翹苷、黃芩苷對照品，用50%甲醇制成0.1822、0.053、1.18mg/mL的混合對照品溶液，0.45μm微孔濾膜濾過,即得。

2.3 供試品溶液制備 分別取10支雙黃連口服液的等量內(nèi)容物混合，精密量取0.5mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液制備 取除去金銀花、連翹、黃芩藥材，按雙黃連口服液制備工藝制備陰性藥品，按供試品溶液制備方法操作，制成缺失金銀花、連翹、黃芩的陰性對照溶液，備用。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗 取金銀花、連翹、黃芩的陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液分別注入液相色譜儀，測定色譜峰，結(jié)果顯示，金銀花、連翹、黃芩的陰性溶液色譜中在與供試品色譜中綠原酸、連翹苷、黃芩苷相同保留時間處，未見色譜峰，表明金銀花、連翹、黃芩的陰性溶液無干擾。結(jié)果見圖1、2、3。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取上述混合對照品溶液2、4、8、10、14、16 μL注入液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。黃芩苷標準曲線方程Y=1890.9X+634.68，R=0.9997，線性范圍為2.36μg～18.88μg。精密量取上述混合對照品溶液5、7.5、10、15、20 μL注入液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。綠原酸標準曲線方程Y=128.98X+19.970，R=0.9998，線性范圍為0.911μg～3.644μg。連翹苷標準曲線方程Y=12.152X+52.111，R=0.9997，線性范圍為0.53～1.06μg。

2.5.3 中間精密度試驗 由3個不同實驗人員，分別在3天，取雙黃連口服液(S-2)，精密量取5mL，按“2.3” 項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，每人重復(fù)測定2次，計算含量。結(jié)果顯示，RSD小于1.5%，表明中間精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取雙黃連口服液(S-2)，按“2.3” 項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別在提取后 0、2、4、6、8、10h取樣，分別注入色譜儀，測定色譜峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液在配制完成后的10h內(nèi)色譜峰面積無明顯變化，表明在10h內(nèi)供試液溶液穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取雙黃連口服液(S-2)6份，按“2.3” 項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定色譜峰面積，計算含量，RSD小于3%，結(jié)果顯示，6次測定結(jié)果的重復(fù)性良好。

2.5.6 準確度試驗 精密量取6份已知含量的雙黃連口服液(S-2)0.25mL，置10mL量瓶中，分別精密加入黃芩苷(1.18mg/mL)5mL、綠原酸(0.1822mg/mL)5mL和連翹苷(0.053mg/mL) 5ml對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，注入色譜儀，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果顯示，3個成分的含量的回收率均在95%～105%之間。

2.7 含量測定 按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，采用外標法計算含量。11個不同廠家雙黃連口服液含量測定結(jié)果有一定差異，其黃芩苷含量在15.055～34.614mg/mL范圍內(nèi)，連翹苷在0.589～2.072mg/mL范圍內(nèi)，綠原酸在0.694～5.781mg/mL范圍內(nèi)，均滿足《中國藥典》2015版一部的含量限度要求，其中S-7(匯利)3種成分的總量最低。結(jié)果見表2。

表2 不同廠家批次雙黃連口服液中黃芩苷、連翹苷、綠原酸含量測定結(jié)果

3 雙黃連口服液指紋圖譜的建立

3.1 供試品溶液制備 分別取10支雙黃連口服液的等量內(nèi)容物混合，精密量取0.5mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過,即得。

3.2 參照物溶液制備 分別精密稱取黃芩苷14.01mg、綠原酸4.24mg、連翹苷5.03mg，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，分別制得黃芩苷標準品溶液1.401mg/mL、綠原酸0.424μg/mL、連翹苷0.503mg/mL。

3.3 陰性溶液的制備 取除去雙黃連口服液，按供試品溶液制備方法操作，制備陰性對照溶液，備用。

3.4 色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動相：甲醇(A)-0.25%冰乙酸(B)；梯度洗脫：0～8min，A(15%～30%)-B(85%～70%)；8～15min，A(30%～33%)-B(70 %～67 %)；15～20min，A(33%～40%)-B(67%～60%)；20～40min，A(40%～43%)-B(60%～57%)；40～50min，A(43%～47%)-B(57%～53%)；50～70min，A(47%～100%)-B(53%～0%)。流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣體積： 10μL；檢測波長：278nm。

3.5 參照物的確定 通過測定11批不同廠家的雙黃連口服液供試品，制劑的色譜峰均在70min之內(nèi)出現(xiàn)，由于對照品黃芩苷、綠原酸、連翹苷為已知成分，且11批制劑中均存在，因此選擇這3個峰作為雙黃連口服液的參照峰。參照色譜圖見圖4。

3.6 共有指紋峰的標定 分別測定陰性溶液與供試品溶液，并且進行比較，排除陰性干擾峰，以黃芩苷、綠原酸、連翹苷為參照物，選擇11個廠家雙黃連口服液指紋圖譜中保留時間與參照物相對比的相對保留時間一致的峰做為共有指紋峰，在《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》中導(dǎo)入11批不同廠家雙黃連口服液的指紋圖譜，對保留時間進行相似度評價。結(jié)果顯示，最終確定共有指紋峰12個，相似度均大于0.99，經(jīng)計算，每個廠家供試品溶液中色譜圖中的共有峰的峰面積之和大于90%，符合共有峰標定要求，共有峰色譜圖見圖5、6、7，相似度評價見表3。結(jié)果顯示不同廠家制劑的指紋圖譜存在差異性。

3.7 方法學(xué)考察

3.7.1 精密度試驗 取供試品溶液，連續(xù)進樣6次，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積的值。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)中導(dǎo)入色譜圖，得到6個圖譜的相似度。結(jié)果表明，圖譜的相似度均大于0.96，符合指紋圖譜分析要求，表明精密度良好。

3.7.2 穩(wěn)定性試驗 取雙黃連口服液，按供試品溶液制備方法制備，分別在0、2、4、6、8、10h進樣，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積的值。結(jié)果，各個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)中導(dǎo)入色譜圖，得到圖譜相似度。結(jié)果表明，10h內(nèi)圖譜相似度均大于0.96，符合指紋圖譜分析要求，表明穩(wěn)定性良好。

3.7.3 重復(fù)性實驗 取同一批號雙黃連口服液6份，按供試品溶液制備方法處理，分別注入色譜儀，考察共有峰相對保留時間和相對峰面積的值。結(jié)果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)中導(dǎo)入色譜圖，得到圖譜相似度。結(jié)果表明，圖譜的相似度均大于0.97，符合指紋圖譜分析要求，表明重復(fù)性良好。

表3 雙黃連制劑指紋圖譜共有峰相似度評價

續(xù)表3 表3 雙黃連制劑指紋圖譜共有峰相似度評價

4 討論

4.1 分別以乙腈-水、甲醇-水等不同比例的流動相系統(tǒng)進行等度和梯度洗脫試驗。結(jié)果表明，用甲醇-0.25%冰乙酸水溶液進行梯度洗脫可同時將三個有效成分黃芩苷、連翹苷、綠原酸在同一個色譜條件下分開，且分離度較好，為此選用文中流動相。

4.2 本法對雙黃連口服液中3種成分同時測定，解決了《中國藥典》中采用3個色譜條件分別測定黃芩苷、連翹苷、綠原酸含量的方法的繁瑣性，操作簡便，提高了雙黃連口服液含量測定效率。

4.3 建立了雙黃連口服液指紋圖譜，標定了12個共有峰，以9號峰(即黃芩苷)為參照，共有峰的相對保留時間分別為：1號(0.200)，2號(0.220)，3號(0.287)，4號(0.358)，5號(0.447)，6號(0.554)，7號(0.713)，8號(0.859)，9號(1.000)，10號(1.285)，11號(1.321)，12號(1.465)，方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于3.0%；以3號峰(即綠原酸)為參照，共有峰的相對保留時間分別為：1號(0.692)，2號(0.760)，3號(1)，4號(1.233)，5號(1.558)，6號(1.910)，7號(2.481)，8號(2.962)，9號(3.463)，10號(4.432)，11號(4.536)，12號(5.058)，方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于3.0%。以8號峰(即連翹苷)為參照，共有峰的相對保留時間分別為：1號(0.234)，2號(0.257)，3號(0.338)，4號(0.416)，5號(0.526)，6號(0.645)，7號(0.837)，8號(1)，9號(1.169)，10號(1.496)，11號(1.531)，12號(1.707)，方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于3.0%。證明此方法可行。

4.4 從11批不同廠家雙黃連口服液指紋圖譜相似度結(jié)果可以看出，不同廠家的雙黃連口服液特征圖譜相似度較高。但是，各共有特征峰相對峰面積存在差異，說明不同廠家雙黃連口服液之間存在質(zhì)量差異。

[1]徐海瑛，王樹芳，王麗, 等.雙黃連口服液聯(lián)合慶大霉素的體外抗菌作用研究 [J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32 (1)：19-22.

[2] 周雪夢，陸春妮，亓文寶，等.清開靈和雙黃連口服液體內(nèi)抗禽流感病毒作用 [J].中草藥，2011，42(7)：1351-1355.

[3] 吳成林，楊占秋，侯煒，等.雙黃連口服液抗呼吸道合胞病毒的實驗研究[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué),2005，18(6)：592-594.

[4] 鄒忠杰，龔夢鵑，王淑美，等.雙黃連口服液抗炎作用的代謝組學(xué)研究 [J].中成藥，2013，35(1)：19.

[5] 劉穎，郭明曄，白根本.綠原酸的研究進展[J].中藥材，2012,37(7)：1182-1183.

[6] 辛文妤，宋俊科，何國榮，等.黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機制研究進展[J].中國新藥，2013,22(6): 647-652.

[7] 魏晉寶，楊光義，陳歡，等.連翹苷的提取方法、藥理毒理及藥動學(xué)研究進展 [J].中國藥師，2015,18(12): 2146.

[8] 徐大志，張榮，劉啟德, 等.HPLC波長轉(zhuǎn)換法同時檢測雙黃連口服液中4種有效成分的含量[J].中藥新藥與臨床藥理, 2012， 23(1)：73-76.

[9] 杜英峰, 張?zhí)m桐, 靳怡然，等.多波長RP-HPLC法測定雙黃連口服液中黃芩苷、綠原酸和連翹苷 [J].中成藥，2009，31(9)：1368-1371.

[10] 班麗娜，徐遠金.HPLC / MS 同時測定雙黃連口服液中的4種有效成分 [J].中成藥，2012，34(2)：265-267.

[11] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：735-736.

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Determination of the Chemical Composition and Fingerprint of the Shuanghuanglian Oral

FENG Hongling1HUANG Sen1LI Murui1ZHANG Hui1*YU Sihui1HAN Li1

1.LiaoNing University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600, China;2.LiaoNing Center for Drug and Device Evaluation and Monitoring,Shenyang 110030,China

Objective The content of chemical constituents in Shuanghuanglian Oral was determined and the fingerprints of chemical constituents were established, which provided the theoretical basis for the quality standard of Shuanghuanglian Oral..Methods Using high performance liquid chromatography, Agilent C18column (250mm×4.6mm, 5μm), the mobile phase of methanol (A) - acetic acid 0.25% Glacial acetic acid B, the flow rate was 1.0mL/min; the column temperature was 30 ℃; the volume of sample is 10μL.Results Shuanghuanglian oral fingerprint was established with 12 common peaks, with 9 peaks (i.e., baicalin) as a reference.The methodological study In accordance with the provisions,RSDwas less than 3.0%.Conclusion Established by baicalin, Phillyrin and chlorogenic acid as reference material,to determine content of Shuanghuanglian oral from different manufacturers and tp establish method of chemical fingerprints, results showed that the fingerprints of different manufacturers have different formulations, this method is simple, reproducible and high precision, which can provide some basis for the quality standard of Shuanghuanglian oral.

Shuanghuanglian Oral ; HPLC;Content Determination; Fingerprint

國家科技部中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(編號：201407002)。

馮宏玲(1989-)，女，漢族，在讀碩士研究生，從事中藥品質(zhì)評價及創(chuàng)新藥物研究。E-mail：1130048489 @qq.com

張慧(1970-)，漢族，博士，教授，從事中藥品質(zhì)評價與創(chuàng)新藥物研究。E-mail:syyycs@163.com

R284

A

1007-8517(2017)05-0017-06

2016-12-22 編輯：穆麗華)