張奮強(qiáng), 劉 歡, 黃麗娜, 姜夢(mèng)嫣, 周義杰, 鄒宇晨, 楊明峰*, 馬蘭青,3*

1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206;2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206;3.北京農(nóng)學(xué)院, 北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心, 北京 102206

樹(shù)莓酮生物合成途徑及關(guān)鍵酶功能研究進(jìn)展

張奮強(qiáng)1, 劉 歡1, 黃麗娜2, 姜夢(mèng)嫣2, 周義杰1, 鄒宇晨2, 楊明峰2*, 馬蘭青2,3*

1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206;2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206;3.北京農(nóng)學(xué)院, 北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心, 北京 102206

樹(shù)莓酮(raspberry ketone)，又稱(chēng)覆盆子酮，其化學(xué)名稱(chēng)為4-對(duì)羥基苯基-2-丁酮[4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone]，是存在于多種植物中的香氣化合物。樹(shù)莓酮不僅因其獨(dú)特的香味被食品行業(yè)和化妝品行業(yè)應(yīng)用，而且樹(shù)莓酮有很好的減肥作用。由于從植物中提取樹(shù)莓酮的成本非常高，而且產(chǎn)量少，導(dǎo)致市售的樹(shù)莓酮價(jià)格含量極高。因此通過(guò)代謝工程的方法來(lái)合成樹(shù)莓酮成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。近十幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于樹(shù)莓酮的生物合成途徑做了大量的研究。總結(jié)了近十幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)于樹(shù)莓酮生物合成途徑的成果，并在此基礎(chǔ)上提出了對(duì)于樹(shù)莓酮生物合成的一些見(jiàn)解,以期對(duì)樹(shù)莓酮生物合成途徑的研究有所啟發(fā)。

樹(shù)莓酮；生物合成；研究進(jìn)展

樹(shù)莓酮(raspberry ketone)，又稱(chēng)覆盆子酮，其化學(xué)名稱(chēng)為4-對(duì)羥基苯基-2-丁酮[4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone]，是存在于桃子、葡萄、蘋(píng)果以及漿果等多種植物中的香氣化合物。此種化合物賦予樹(shù)莓獨(dú)有的特征性香氣，因此稱(chēng)其為樹(shù)莓酮。在樹(shù)莓果實(shí)的成熟階段，樹(shù)莓酮的含量最高[1, 2]。樹(shù)莓酮不僅因其獨(dú)特的香味在食品和化妝品領(lǐng)域備受青睞，而且因其具有多種藥用價(jià)值[3]，近年來(lái)也收到制藥行業(yè)的關(guān)注。但是，樹(shù)莓酮在植物中的含量非常少，每千克果實(shí)中僅含幾毫克樹(shù)莓酮，而且純化成本過(guò)高，因此通過(guò)從植物中提取樹(shù)莓酮遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到市場(chǎng)的需求。通過(guò)化學(xué)合成的方法雖然比從植物中提取樹(shù)莓酮要簡(jiǎn)單而且大量，但是合成過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)許多有毒的副產(chǎn)物，而且合成的樹(shù)莓酮被視為非自然化合物，不符合食品法[4]。這些因素導(dǎo)致市售的樹(shù)莓酮價(jià)格高達(dá)每千克20 000美元。因此,研究者們開(kāi)始尋找既高效又綠色的生物合成方法合成樹(shù)莓酮。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多專(zhuān)家和學(xué)者對(duì)樹(shù)莓酮的合成途徑做了許多相關(guān)的研究和報(bào)道，對(duì)樹(shù)莓酮的合成途徑有了較為清晰的認(rèn)識(shí)。本文總結(jié)了近年來(lái)有關(guān)樹(shù)莓酮生物合成的相關(guān)研究成果，并對(duì)樹(shù)莓酮存在的兩種途徑(植物途徑和微生物途徑)做了比較，希望為樹(shù)莓酮生物合成途徑的研究提供新的視野與思路。

1 樹(shù)莓酮的生物合成途徑

樹(shù)莓酮在植物中的生物合成前體來(lái)自于苯丙烷代謝途徑(phenylpropanoid pathway)，即苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)的作用下生成肉桂酸，之后肉桂酸在肉桂酸-4-羥基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)的作用下生成4-香豆酸，最后4-香豆酸在4-香豆酰輔酶A連接酶(4-coumarate-CoA ligase， 4CL)的作用下生成4-香豆酰輔酶A[5～7]，此為合成樹(shù)莓酮的其中一個(gè)底物(圖1)。苯亞甲基丙酮合成的另一個(gè)底物是丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)，此化合物是乙酰輔酶A(acetyl CoA)通過(guò)乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, AACase)作用形成的。之后這兩種底物在苯亞甲基丙酮合酶(benzalacetone synthase，BAS)的作用下，通過(guò)脫羧縮合反應(yīng)生成苯亞甲基丙酮，苯亞甲基丙酮再通過(guò)苯亞甲基丙酮還原酶(benzalacetone reductase，BAH)的作用生成樹(shù)莓酮[1, 2, 8](圖1)。

樹(shù)莓酮不僅在植物中可以合成，在微生物中同樣可以，只是方式有所不同。分別用1-13C、2-13C、3-13C標(biāo)記的苯丙氨酸供給Nidulaniveotomentosa，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有用3-13C標(biāo)記的苯丙氨酸供給時(shí)才能檢測(cè)到有同位素標(biāo)記的苯亞甲基丙酮[9]； Fischer等[10]在研究真菌催化合成樹(shù)莓酮時(shí)，發(fā)現(xiàn)用含有C6-C1結(jié)構(gòu)的化合物做底物(如 馬尿酸)比用含有C6-C3結(jié)構(gòu)的化合物做底物前期合成效率更高，這有可能是C6-C1結(jié)構(gòu)的化合物比C6-C3結(jié)構(gòu)的化合物更易于通過(guò)細(xì)胞膜，有趣的是含有C6-C2結(jié)構(gòu)的化合物卻不能作為底物來(lái)合成苯亞甲基丙酮，這說(shuō)明在真菌合成樹(shù)莓酮時(shí)很有可能是先將C6-C3結(jié)構(gòu)的化合物分解為C6-C1結(jié)構(gòu)的化合物，進(jìn)而再進(jìn)行側(cè)鏈的延伸，而這種分解方式是以二碳為單位進(jìn)行的。這種催化方式與之前所述的植物中樹(shù)莓酮的合成途徑有所區(qū)別(圖1)，而催化C6-C3結(jié)構(gòu)變?yōu)镃6-C1結(jié)構(gòu)的相關(guān)酶還沒(méi)有明確的報(bào)道。另外，此研究發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A羧化酶抑制劑能抑制丙二酰輔酶A的合成，苯亞甲基丙酮的產(chǎn)量也隨之降低，這表明真菌合成樹(shù)莓酮時(shí)，側(cè)鏈延伸所用的底物與植物中合成樹(shù)莓酮時(shí)側(cè)鏈延伸所用的底物都是丙二酰輔酶A，只不過(guò)前者在側(cè)鏈縮合的過(guò)程中需要兩分子的丙二酰輔酶A[9]，而通過(guò)植物途徑合成樹(shù)莓酮時(shí)只需1分子的丙二酰輔酶A，這說(shuō)明兩種不同的生物合成途徑在合成樹(shù)莓酮時(shí)所用的底物不同，催化方式也不同。此外，Kosjek等[11]發(fā)現(xiàn)在馬紅球菌凍干細(xì)胞中存在一種仲醇脫氫酶(secondary alcohol dehydrogenase，ADH)，這種酶可以將4-對(duì)羥基苯基-2-丁醇(杜鵑醇)脫氫氧化生成樹(shù)莓酮(圖1)。在上述幾個(gè)研究中，研究者同樣能在產(chǎn)物中檢測(cè)到含有同位素標(biāo)記的4-對(duì)羥基苯基-2-丁醇[9, 10]，這表明在其他菌種中也有可能存在仲醇脫氫酶，與其他途徑協(xié)同催化樹(shù)莓酮的合成。

2 樹(shù)莓酮生物合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶

2.1 苯亞甲基丙酮合酶(BAS)

苯亞甲基丙酮合酶(BAS)是植物合成樹(shù)莓酮過(guò)程中催化4-香豆酰輔酶A與丙二酰輔酶A脫羧縮合生成苯亞甲基丙酮的關(guān)鍵酶。BAS基因最早是從掌葉大黃中克隆分離得到的[5]，經(jīng)分析，該基因編碼42 kDa的氨基酸，與CHS超家族中其他成員(如)編碼的氨基酸序列有60%～75%的相似性。值得注意的是，該基因編碼的氨基酸序列與CHS相比缺少215位的苯丙氨酸，但是保留了具有催化活性的半胱氨酸-組氨酸二聚體。Jules等[12]利用定點(diǎn)突變分別將RiCHS基因214位的Leu和215位的Phe突變?yōu)镮le和Leu，即RiCHS-Mut。通過(guò)體外酶促反應(yīng)得知，在體外條件下，RiCHS合成苯亞甲基丙酮的活性要比RiCHS-Mut高的多。此外，馬蘭青等[6,7]從虎杖中成功克隆分離到的基因PcPKS1和PcPKS2，經(jīng)過(guò)分析，基因PcPKS2為BAS，而PcPKS1編碼的蛋白具有CHS和BAS雙功能酶活性，而且雙功能酶PcPKS1表現(xiàn)出的BAS活性要比PcPKS2高約70倍。

圖1 樹(shù)莓酮生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of raspberry ketone.A為植物途徑；B為微生物途徑；圖中實(shí)線框表示的部分為可能存在的步驟。4CL：4-香豆酰輔酶A連接酶；ADH:仲醇脫氫酶；BAS：苯亞甲基丙酮合酶；C4H：肉桂酸-4-羥基化酶；PAL：苯丙氨酸解氨酶；酶1和酶2到目前為止還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道

值得注意的是，上述這些研究中，雙功能酶表現(xiàn)出高的BAS活性時(shí)的pH與BAS單功能酶非常相似，這說(shuō)明在高pH條件下有利于催化苯亞甲基丙酮的合成；與CHS相比，BAS缺少了215位的苯丙氨酸，而且雙功能酶表現(xiàn)出的BAS活性要比BAS單功能酶高的多，因此CHS中的苯丙氨酸更有利于酶與底物的結(jié)合。Lee等[13]研究發(fā)現(xiàn)將4CL和BAS融合基因?qū)脶劸平湍钢羞M(jìn)行培養(yǎng)，可以得到高產(chǎn)量的樹(shù)莓酮。到目前為止，專(zhuān)門(mén)起B(yǎng)AS作用的基因仍然沒(méi)有從樹(shù)莓中克隆分離。

2.2 苯亞甲基丙酮還原酶(BAH)

苯亞甲基丙酮還原酶是催化樹(shù)莓酮生物合成的最后一步關(guān)鍵酶，它催化苯亞甲基丙酮還原成樹(shù)莓酮。Takao等[14]從樹(shù)莓中克隆分離到了具有該活性的RZS，該酶是一個(gè)雙功能酶，即樹(shù)莓酮/姜油酮合酶。這也是首次從高等植物中克隆分離到的具有編碼苯亞甲基丙酮還原酶活性的基因，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)與其他還原酶不同，該酶具有很高的底物特異性，特異識(shí)別丁烯基側(cè)鏈中的α、β不飽和鍵，此外H?kkinen等[15]發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行其他植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，其他植物細(xì)胞(如煙草)也具有將苯亞甲基丙酮轉(zhuǎn)化成樹(shù)莓酮的能力。Jules等[12]在研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌和真菌中同樣也存在著具有苯亞甲基丙酮還原酶活性的酶，不過(guò)目前還沒(méi)有對(duì)微生物中存在的這種酶做相關(guān)的研究與鑒定。

3 展望

樹(shù)莓酮，這種存在于多種植物中的化合物，以其自身獨(dú)特的性質(zhì)，近年來(lái)備受食品、化妝品以及制藥行業(yè)等領(lǐng)域的青睞。但是因其在植物中含量很少并且通過(guò)化學(xué)合成方法有諸多的限制因素，因此通過(guò)生物方法來(lái)合成樹(shù)莓酮成了研究的熱點(diǎn)。經(jīng)過(guò)十幾年的研究，樹(shù)莓酮在植物中的合成途徑已經(jīng)漸漸被人們所熟知，最為清楚的苯丁烷代謝途徑，即BAS催化4-香豆酰輔酶A與丙二酰輔酶A脫羧縮合生成苯亞甲基丙酮，之后在苯亞甲基丙酮還原酶的作用下生成樹(shù)莓酮。但是，樹(shù)莓酮在植物體內(nèi)的合成絕不止這一條途徑，比如Fischer等[9]在研究Nidulaniveotomentosa合成樹(shù)莓酮時(shí)，該菌所用的途徑就不是苯丁烷代謝途徑，Kosjek等[11]在研究馬紅球菌合成樹(shù)莓酮時(shí)發(fā)現(xiàn)乙醇脫氫酶可催化杜鵑醇生成樹(shù)莓酮等。

BAS是合成樹(shù)莓酮過(guò)程中的關(guān)鍵酶，但決不僅僅是BAS才能合成苯亞甲基丙酮，還存在1種CHS/BAS雙功能酶也能催化苯亞甲基丙酮的合成。有趣的是，雙功能酶催化苯亞甲基丙酮合成時(shí)的反應(yīng)pH與BAS合成苯亞甲基丙酮時(shí)的反應(yīng)pH相似[6]。這表明pH可能通過(guò)影響酶的結(jié)構(gòu)，從而影響酶促反應(yīng)產(chǎn)物。4CL和BAS融合基因的研究說(shuō)明相對(duì)于BAS來(lái)說(shuō)，催化樹(shù)莓酮合成最后一步起還原作用的酶可能不那么受重視，但是其在整個(gè)樹(shù)莓酮合成過(guò)程中卻是不可缺少的。Takao等[14]首次從樹(shù)莓中成功克隆分離得到了催化樹(shù)莓酮合成最后一步的還原酶RZS1，不僅在樹(shù)莓中存在催化樹(shù)莓酮合成最后一步的還原酶，H?kkinen等[15]研究發(fā)現(xiàn)在其他一些不相關(guān)的植物中也存在將苯亞甲基丙酮轉(zhuǎn)化成樹(shù)莓酮的還原酶；Jules等[12]通過(guò)研究證明了細(xì)菌及真菌中都存在NADPH依賴(lài)性的還原酶，至于是哪種酶，目前還沒(méi)有鑒定。

雖然近十幾年來(lái)對(duì)于樹(shù)莓酮生物合成途徑的報(bào)道不少，相關(guān)的合成途徑也研究的比較清晰。但是適用于樹(shù)莓酮批量合成的方式仍然沒(méi)有找到。通過(guò)發(fā)酵的方法來(lái)合成人們所需要的化合物一直被廣大企業(yè)所采用，就是因?yàn)橛糜诎l(fā)酵的微生物有生存能力強(qiáng)、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)。目前有關(guān)樹(shù)莓酮代謝工程方面的研究有基因的定點(diǎn)突變[12]、融合基因[13]等。本文總結(jié)并比較了近年來(lái)樹(shù)莓酮生物合成途徑中相關(guān)酶的催化性能，對(duì)于今后的樹(shù)莓酮代謝工程有一定的指導(dǎo)意義，為今后通過(guò)微生物大量生產(chǎn)樹(shù)莓酮提供了借鑒。

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Progress on Biosynthesis Pathway and Function of Key Enzyme in Raspberry Ketone

ZHANG Fenqiang1, LIU Huan1, HUANG Lina2, JIANG Mengyan1, ZHOU Yijie2, ZOU Yuchen2, YANG Mingfeng2*, MA Lanqing2,3*

1.KeyLaboratoryofUrbanAgriculture(NorthChina),MinistryofAgriculture,PlantScienceandTechnologyCollege,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China2.KeyLaboratoryofUrbanAgriculture(NorthChina),MinistryofAgriculture,CollegeofBiologicalScienceandEngineering,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;3.BeijingCollaborativeInnovationCenterforEco-environmentalImprovementwithForestryandFruitTrees,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China

Raspberry ketone is a kind of aroma compound, its chemical name is 4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone, which is existing in many kinds of plants. Raspberry ketone is not only applied in food industries and comestic industries as its unique flavor, but also has good effect on loseing weight. The cost that abstract raspberry ketone from plants is exceedingly high and the yield is very low, which leads high price of raspberry ketone. So through metabolic engineering to synthesize raspberry ketone has become research hotspots recently. In recent ten years, there are many research on biosynthesis pathway of raspberry ketone at home and abroad. The paper summarized the achivements on biosynthesis pathway of raspberry ketone and proposed some opinions, which was expected to provide reference for further study on raspberry ketone biosynthesis.

raspberry ketone; biosynthesis pathway; research progress

2016-11-16; 接受日期：2016-12-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21606020)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2164059);北京市科技創(chuàng)新服務(wù)能力建設(shè)-協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(PXM2017_014207_000043)資助。

張奮強(qiáng)，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡?shù)品質(zhì)優(yōu)質(zhì)生態(tài)安全。E-mail: huanliu0824@163.com。*通信作者：楊明峰，副教授，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)和植物代謝調(diào)控研究。E-mail: mingfengyang@bua.edu.cn；馬蘭青，教授，研究方向?yàn)橹参锎紊x分子調(diào)控。E-mail：lqma713@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.02.05