崔艷麗/黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所

新支減流四聯(lián)滅活疫苗最小免疫劑量確定及免疫效果評價

崔艷麗/黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所

雞新城疫（ND）、雞傳染性支氣管炎（IB）、雞減蛋綜合征（EDS）和禽流感（AI）是危害養(yǎng)禽業(yè)最主要的傳染病，具有高致病力和高死亡率特點，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，現(xiàn)在針對新型疫苗毒株不斷出現(xiàn)，在養(yǎng)殖實際中需要科學(xué)的免疫程序，以便充分發(fā)揮新疫苗的免疫效力。哈藥集團生物疫苗有限公司(以下簡稱哈藥疫苗)推出了雞新城疫、傳染性支氣管炎、減蛋綜合征、禽流感（H9亞型）四聯(lián)滅活疫苗（La Sota株+M41株+HS25株+HZ株）四聯(lián)滅活苗，為驗證該疫苗的實際免疫效果并制定科學(xué)的免疫程序，并通過血凝抑制試驗(HI)和攻毒保護(hù)試驗對疫苗的免疫效果進(jìn)行了評價。結(jié)果顯示，四聯(lián)滅活疫苗具有很好的免疫效力，均達(dá)到我國、發(fā)達(dá)國家和國際組織的標(biāo)準(zhǔn)。隨機抽取試驗雞，進(jìn)行攻毒試驗，100%保護(hù)。四聯(lián)滅活疫苗最小免疫劑量為 62．5ul，正常接種劑量（0．5ml）含8個最小免疫劑量。為進(jìn)一步證實該產(chǎn)品在實際生產(chǎn)中的防控作用，實施如下試驗，希望能夠?qū)V大養(yǎng)殖業(yè)者的防控提供實驗數(shù)據(jù)。

一、材料與方法

1.材料。

（1）試驗用四聯(lián)滅活疫苗。

疫苗：ND-IB-EDS76-AI（H9）四聯(lián)滅活苗由哈藥集團生物疫苗有限公司生產(chǎn)，批號：201601

種毒：NDV La Sota株、IBV M41株、ND強毒CVCC AV1611株購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

AIV HZ株、EDSV HS25株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分離鑒定，哈藥集團生物疫苗有限公司保存和供應(yīng)。

（2）檢測用血凝抗原和抗血。

NDV抗原和抗血清由本實驗室制備，HA抗原效價≥1∶512；抗血清HI≥1∶256。

IBV(M41株)抗原和抗血清IBV（M41株）HA抗原購自荷蘭GD公司?？寡逵蓪嶒炇易灾疲×糠盅b，-70℃保存，HI≥1∶256。

EDS76V(HS25株)抗原和抗血清由實驗室制備，HA抗原效價≥1∶10240；抗血清HI≥1∶256。

AIV(HZ株)抗原和抗血清由實驗室制備，HA抗原效價≥1∶256；抗血清HI≥1∶256。

（3）試驗用動物。

SPF雞：從山東農(nóng)科院購買SPF雞胚，自行孵化，在相對隔離的環(huán)境中飼養(yǎng)。

商品蛋雞：從哈爾濱市市郊某雞場購買，并隔離飼養(yǎng)。

2.主要儀器。

3.試驗方法。

（1）免疫效力試驗。

①四聯(lián)滅活疫苗ND部分免疫效力試驗：用28日齡SPF雞15只，其中10只各皮下注射疫苗20μl（1/25羽份），另5只作對照。接種后21日，每只雞采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價測定。

②四聯(lián)滅活疫苗IB(M41株)部分免疫效力試驗：用14日齡SPF雞10只，各點眼接種雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120）1羽份。接種后21日，分別采血，同時各皮下注射滅活疫苗0．5m1，注射后21日，再分別采血，分離血清。分別測定兩次血清HI抗體效價。

③四聯(lián)滅活疫苗EDS(HS25株)部分免疫效力試驗：用21日齡SPF雞15只，其中10只經(jīng)頸部接種滅活疫苗0．5mL，另5只不接種，作對照。注射后21日，分別采血，分離血清，檢測抗EDS76V的HI抗體。

④四聯(lián)滅活疫苗AI(H9)部分免疫效力試驗：用21日齡SPF雞15只，其中10只各皮下注射疫苗0．3ml，另5只作對照。接種后21日，每只雞采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價測定。同時，各靜脈注射H9亞型禽流感病毒HZ株0．2ml（≥107．0EID50），攻毒后第5日，采集每只雞的泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離。將每只雞的樣品經(jīng)尿囊腔內(nèi)接種9～11日齡SPF雞胚5枚。孵育觀察5日，無論死胚、活胚均應(yīng)測定雞胚液血凝價，以5枚雞胚中至少有1枚雞胚的雞胚液血凝價不低于1：16（微量法）判為病毒分離陽性。對病毒分離為陰性的樣品，應(yīng)盲傳1次，再次測定HA價。

（2）最小免疫劑量確定。用生理鹽水為水相，與油相按1∶2的比例混合，乳化，制成疫苗稀釋劑。疫苗稀釋劑與疫苗按照1∶3、1∶7、1∶15的比例，將疫苗稀釋至原來的1/4、1/8、1/16。用320只100日齡蛋雞。

雞平均分成2組，第一組為對照組，160只，不免疫。另一組為免疫組，160只，在100日齡時，每只雞滴鼻接種傳染性支氣管炎活疫苗（H120株），1羽份/只。免后30日即蛋雞130日齡時，將這160只雞再平均分成4小組，即每小組40只。每小組分別免疫1、1/4、1/8、1/16劑量的四聯(lián)疫苗，0．5ml/只。免疫60天，采血，分離血清，分別檢測抗NDV、IBV、EDSV和AIV(H9)的HI抗體。每小組的40只雞再分成10只一組，各用NDV北京株（CVCC AV1611）、IBV M41株、EDS76V HS25株和AI(H9) HZ株分別攻毒，同時，設(shè)對照，每種病毒攻擊10只。

二、效力檢驗結(jié)果

1.四聯(lián)滅活疫苗ND免疫效力試驗。接種四聯(lián)疫苗后，ND組免疫組雞HI抗體效價的幾何平均值為1∶51．2，遠(yuǎn)高于歐盟和國家標(biāo)準(zhǔn)“1∶16”。結(jié)果見表1。

2.四聯(lián)滅活疫苗IB免疫效力試驗。試驗表明，首免血清平均HI 抗體效價為1∶12．8；二免血清平均HI抗體效價為1∶67．2，二免血清HI抗體效價的幾何平均值是首免血清的5．25倍。而此項國家標(biāo)準(zhǔn)為“3倍”，該疫苗的效價遠(yuǎn)高于國家標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見表2。

3.四聯(lián)滅活疫苗EDS免疫效力試驗。試驗表明，接種四聯(lián)疫苗后，EDS組免疫組雞HI抗體效價的幾何平均值為1∶243．2，遠(yuǎn)高于國家標(biāo)準(zhǔn)“1∶128”，結(jié)果見表3。

表1 ND組效力試驗HI抗體效價測定結(jié)果

表2 IB組效力試驗HI抗體效價測定結(jié)果

表3 EDS組效力試驗HI抗體效價測定結(jié)果

4.四聯(lián)滅活疫苗AI(H9)免疫效力試驗。試驗表明，接種四聯(lián)疫苗后，AI(H9)組免疫組雞HI抗體效價的幾何平均值為1∶134．4，遠(yuǎn)高于國家標(biāo)準(zhǔn)“1∶90”，結(jié)果見表4。免疫攻毒試驗表明，經(jīng)四聯(lián)苗免疫的雞，對AIV HZ株的攻毒保護(hù)率為100%，結(jié)果見表5。

5.四聯(lián)滅活疫苗對SPF蛋雞最小免疫劑量的確定。給130日齡SPF雞接種不同劑量四聯(lián)滅活疫苗，分別為正常免疫劑量（0．5 mL）的1、1/4、1/8和1/16，免疫60天采血，測ND和AI(H9)的HI抗體，并且分別攻毒。接種劑量為31．25 uL/只(0．5 mL的1/16)，ND的HI抗體效價最低為6．2 log2，攻毒保護(hù)率最低為90%，因此，四聯(lián)疫苗中ND部分對SPF雞的最小免疫劑量至少為31．25 uL，正常免疫劑量（0．5 mL）最低含16個最小免疫劑量。接種劑量為31．25 uL/只(0．5 mL的1/16)，AI(H9)的HI抗體效價最低為6．2 log2，攻毒保護(hù)最低為90%，因此，四聯(lián)疫苗中AI(H9)部分對SPF雞的最小免疫劑量至少為31．25 uL，正常免疫劑量（0．5 mL）最低含16個最小免疫劑量。結(jié)果見表6和表7。

給130日齡SPF雞接種不同劑量四聯(lián)滅活疫苗，分別為正常免疫劑量（0．5 mL）的1、1/4、1/8和1/16，免疫60天采血，測IB和EDS76的HI抗體，并且分別攻毒。接種劑量為62．5 uL/只(0．5 mL的1/8)，IB的HI抗體最低為1∶84．4，高于攻毒前抗體效價（1∶22．6）的3倍，相對產(chǎn)蛋率達(dá)到80%以上；而接種劑量為31．25 uL/只(0．5 mL的1/16)，IB的HI抗體最高為1∶42．2，低于攻毒前抗體效價（1∶22．6）的3倍，相對產(chǎn)蛋率低于80%，因此，四聯(lián)疫苗中IB部分對SPF雞的最小免疫劑量至少為62．5 uL，正常免疫劑量（0．5 mL）最低含8個最小免疫劑量。同樣，對于EDS76，接種劑量為31．25 uL/只(0．5mL的1/16)，EDS76的HI抗體效價最低為6．1 log2，相對產(chǎn)蛋率達(dá)到80%以上，因此，四聯(lián)疫苗中EDS76部分對SPF雞的最小免疫劑量至少為31．25 uL，正常免疫劑量（0．5 mL）最低含16個最小免疫劑量。結(jié)果見表7。

表4 AI(H9)組效力試驗HI抗體效價測定結(jié)果

表5 AI(H9)組免疫攻毒試驗結(jié)果

表6 四聯(lián)滅活疫苗ND和AI(H9)對SPF雞最小免疫劑量的確定

三、討論和結(jié)論

疫苗具有很好的免疫效力，均達(dá)到我國、發(fā)達(dá)國家和國際組織的標(biāo)準(zhǔn)，在疫苗免疫與現(xiàn)地試驗中均可達(dá)到良好的免疫效果，并且進(jìn)行了免疫攻毒試驗，100%保護(hù)；四聯(lián)滅活疫苗的4種抗原對產(chǎn)蛋雞的最小免疫劑量是不同的。對于ND、EDS76和AI(H9)的最小免疫劑量最小，為31．25 uL，正常接種劑量（0．5 mL）至少含16個最小免疫劑量；而對于IB，最小免疫劑量為62．5 uL，正常接種劑量（0．5 mL）含8個最小免疫劑量，因此，綜合考慮，四聯(lián)疫苗對產(chǎn)蛋雞的最小免疫劑量確定62．5 uL，正常接種劑量（0．5 mL）含8個最小免疫劑量。

通過以上的結(jié)果顯示四聯(lián)滅活

表7 四聯(lián)滅活疫苗IB和EDS76對SPF雞最小免疫劑量的確定1