秦 珂，曾檢華，薛 明，宋德清，楊紅杰，何祖勇，劉小紅

（1．中山大學生命科學學院/有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510006；2．廣東壹號食品股份有限公司，廣東 廣州 510620；3．全國畜牧總站，北京 100125）

杜洛克×陸川豬雜交F1代MC1R基因型分析

秦 珂1，曾檢華2，薛 明3，宋德清2，楊紅杰3，何祖勇1，劉小紅1

（1．中山大學生命科學學院/有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510006；2．廣東壹號食品股份有限公司，廣東 廣州 510620；3．全國畜牧總站，北京 100125）

為了解釋杜洛克和陸川豬雜交F1代毛色分離現(xiàn)象，以5窩黑毛全同胞杜陸仔豬及其母本為對照，利用PCR測序法對4窩毛色異常全同胞杜陸仔豬及其母本的MC1R基因型進行分析。結(jié)果表明，5窩黑毛全同胞杜陸仔豬MC1R基因型均為ED1/e，母本MC1R基因型均為ED1/ ED1；4窩毛色異常全同胞杜陸仔豬中，黑毛杜陸豬MC1R基因型均為ED1/e，紅毛杜陸豬MC1R基因型均為e/e，母本MC1R基因型均為ED1/e。由于純種杜洛克MC1R基因型為e/e，純種陸川豬MC1R基因型為ED1/ ED1，理論上其雜交F1代杜陸豬MC1R基因型應該為ED1/e，毛色表現(xiàn)為黑色。研究結(jié)果顯示，產(chǎn)毛色分離仔豬的母本為雜合子，含有杜洛克血統(tǒng)，因此，雜合子母豬和杜洛克雜交產(chǎn)生MC1R基因型表現(xiàn)為純種杜洛克所特有的e/e，子代表現(xiàn)為紅毛，從分子水平揭示了杜陸豬毛色分離的原因。以MC1R基因為分子標記可以指導豬場快速淘汰雜合子陸川豬母本，迅速純化基礎(chǔ)群。

杜洛克；陸川豬；杜陸豬；毛色分離；MC1R基因

在動物育種工作中，毛色作為動物最直觀的一個表型性狀，同時也是一種可利用的遺傳標記，可以幫助確定雜交組合、品種純度和親緣關(guān)系等。豬的毛色表型豐富多樣，可分為野灰色、全黑、全紅、全白、多米諾黑點、黑紅斑塊、黑底白點等類型?？刂泼幕蜉^為復雜，目前在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)378個與毛色相關(guān)的遺傳位點和171個毛色相關(guān)基因［1］，如黑素皮質(zhì)素受體1基因（Melanocortin receptor 1 gene，MC1R）［2］、v-kit貓科肉瘤病毒轉(zhuǎn)化基因（v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog，KIT）［3］、內(nèi)皮素受體B基因（Endothelin receptor B gene，EDNRB）［3］和小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)綠因子基因（Microphthalmiaassociated transcription factor，MITF）［4］等，涉及到黑色素細胞前體物的生長、存活、遷移、分化以及色素的合成等重要生理、生化過程［5］。

黑皮質(zhì)素受體1（MC1R），也稱為黑素細胞刺激激素受體（MSHR），屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族成員，是參與調(diào)節(jié)哺乳動物皮膚和毛發(fā)顏色的關(guān)鍵蛋白質(zhì)之一。它在表皮和毛囊的黑色素細胞中表達。MC1R通過與其配體促進劑α-黑素細胞刺激激素（α-MSH）或拮抗劑刺鼠蛋白（Agouti）的競爭性結(jié)合分別形成真黑素和褐黑素，從而影響豬的毛色表型［6］。Gustafsson等［7］根據(jù)前人的研究，對9個豬種的MC1R基因定義了5種基因型E+、ED1、ED2、Ep、e（顯性順序為ED1/ED2＞E+＞Ep＞e），其中，E+對應野豬的野灰色表型、ED1對應歐洲大黑豬和中國梅山豬的黑色表型、ED2對應漢普夏的黑毛色表型、Ep對應皮特蘭的斑塊表型、e對應杜洛克的紅毛色表型。Fang等［8］根據(jù)5種MC1R基因型總結(jié)了13種單倍型，其中基因型E+、ED1、ED2、Ep、e分別對應5、3、1、3、1種單倍型。Evagelia等［9］和Klomtong［10］等提出根據(jù)MC1R基因型在不同豬種間的差異性，可作為鑒定豬種的分子標記。Linderholm等［11］利用線粒體DNA多態(tài)性，并結(jié)合MC1R基因124密碼子第1個堿基G＞A錯義突變，鑒定出夏威夷豬具有歐洲豬血統(tǒng)。本實驗室最近研究表明，5個華南地方豬種（陸川豬、大花白豬、巴馬香豬、粵東黑豬、莆田黑豬）MC1R基因型均為ED1/ED1，存在兩個特殊堿基突變（283G＞A、305T＞C），導致兩個氨基酸的錯義突變（Val＞Met、Leu＞Pro），明顯區(qū)別于外國豬種如大白豬、長白豬、皮特蘭、杜洛克等。因此，MC1R基因可以作為一種有效的分子標記鑒定陸川豬群體的純度。

在實際養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，杜洛克和陸川豬雜交F1代杜陸豬毛色一般表現(xiàn)為全黑色。而在規(guī)模化商業(yè)養(yǎng)殖的情況下，有少量F1代杜陸豬毛色表現(xiàn)為類似于杜洛克的紅毛，存在一定比例毛色分離個體，嚴重影響商品豬的一致性和經(jīng)濟性。因此，本研究通過鑒定杜陸豬及其母本的MC1R基因型，旨在從分子水平揭示杜陸豬毛色分離的原因，以期指導豬場快速淘汰雜合子陸川豬母本，迅速純化基礎(chǔ)群。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 供試豬只共59頭，其中杜洛克父本3頭、陸川豬母本9頭、杜陸仔豬47頭（包括5窩毛色正常全同胞杜陸仔豬和母本、4窩毛色分離全同胞杜陸仔豬和母本），均來源于廣東壹號食品股份有限公司。采集的樣本均為豬耳組織，現(xiàn)場取樣后經(jīng)生理鹽水洗凈，置于75%乙醇中，盡快送達實驗室，直接提取基因組或保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 基因組提取試劑盒Qiagen Dneasy Blood&Tissue Kit，購于廣州昂科生物科技有限公司；Genstar 2×Taq PCR StarMix with Loading Dye，購于北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；東盛DS2000 marker，購于廣州東盛生物科技有限公司；SYBR-Green I核酸染料，購于北京普博欣生物科技有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組提取 采用基因組提取試劑盒Qiagen Dneasy Blood&Tissue Kit抽提DNA樣品，并使用分光光度計測定DNA樣品濃度和純度，稀釋樣品濃度至100～200 ng/μL，然后存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 參考GenBank已公布MC1R基因序列（登錄號：AY365250.1），使用Primer primer 5軟件設(shè)計MC1R基因檢測引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為MC1R-F：TGTCATGGACGTGCTCATCTG，MC1R-R：GGTCCACGATGGAGTTGCAG，預期擴增片段大小為530 bp。

1.2.3 PCR反應 PCR反應體系為50 μL：模板DNA 1 μL（100～200 ng/μL），上下游引物各1 μL（10 pmol/μL），PCR Mix 25 μL，補充ddH2O 22 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸40 s，36個循環(huán)；72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測，4℃保存或直接送測序。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序和序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測合格后，送到廣州艾基生物技術(shù)有限公司進行純化和測序；測序結(jié)果使用Vector NTI 11.5.1軟件進行序列比對，檢測遺傳變異位點；使用Chromas 2.22軟件查看測序結(jié)果峰圖，最終確認突變堿基類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛色表型分析

純種杜洛克原產(chǎn)于美國東部的新澤西州和紐約州等地，毛色表現(xiàn)為紅色和白色兩種，本試驗樣本為紅色雄性杜洛克；純種陸川豬產(chǎn)于華南地區(qū)，皮膚顏色呈一致性的黑白花，頭、耳、背、腰、臀及尾為黑色，其余部位為白色，在黑白交界處有一條約4～5 cm白毛黑皮的“暈”，本試驗所選擇母本毛色表型均符合純種陸川豬特征；正常杜陸豬表型應表現(xiàn)為全身黑色，本試驗選擇9窩杜陸豬仔豬，其中5窩為全黑色，4窩存在黑色和紅色毛色分離現(xiàn)象（圖1，彩插一）。

2.2 PCR擴增結(jié)果分析

利用引物MC1R-F、MC1R-R對樣本MC1R基因進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結(jié)果（圖2）顯示，PCR產(chǎn)物電泳條帶出現(xiàn)微弱雜帶，其中主帶大小與預期目的片段大小530 bp一致，符合預期結(jié)果，可以經(jīng)膠回收后用于DNA測序。

圖2 MC1R基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 測序結(jié)果分析

2.3.1 序列比對 相對于海南野豬，杜洛克MC1R基因在第164、243密碼子存在兩個獨特的錯義突變451C＞T、727G＞A，引起兩個氨基酸的變化，陸川豬在第243密碼子存在無義突變729G＞A，這種突變目前僅在中國地方豬種中發(fā)現(xiàn)。因此，本試驗通過檢測這3個SNP，用以鑒定陸川豬母本的純度和分析杜陸仔豬毛色分離的原因。測序結(jié)果使用Vector Nti進行序列比對，以純種杜洛克和陸川豬MC1R基因序列為對照，發(fā)現(xiàn)母本1、2、3、4、5為純合陸川豬，其黑毛仔豬在堿基451C＞T、727G＞A、729G＞A處存在突變，堿基序列表現(xiàn)為不同的單倍型，表現(xiàn)為雜合子；母本6、7、8、9及其黑毛仔豬MC1R基因型均為雜合型，而紅毛仔豬均表現(xiàn)為純合杜洛克MC1R基因型（圖3）。

2.3.2 圖譜分析 使用Chromas軟件查看測序峰圖，結(jié)果（圖4，彩插一）顯示，對照樣本中，母本1、2、3、4、5峰圖單一，MC1R基因型為ED1/ ED1；其仔豬毛色為全黑，在堿基451、727、729處均存在雙峰，MC1R基因型為雜合子ED1/e。試驗樣本中，母本6、7、8及黑毛仔豬在堿基451、727、729均為雙峰，基因型為雜合子ED1/e；紅毛仔豬峰圖單一，均為純合子，表現(xiàn)為杜洛克基因型e/e。不同于母本6、7、8，母本9在堿基451、727處均存在雙峰，在堿基729處為單一峰，基因型為ED1/e；黑毛仔豬MC1R基因型為雜合子ED1/e；紅毛仔豬MC1R基因型為純合子e/e（表2）。

圖3 窩號1、6和9 MC1R基因測序序列比對結(jié)果

表1 MC1R基因型統(tǒng)計

3 結(jié)論與討論

在豬的育種中，雜交育種是現(xiàn)代豬育種的基本方法，可以綜合各個品種的優(yōu)良性狀，幾乎所有商品豬如杜長大都是通過雜交配套選育而來。我國地方豬品種多，遺傳資源豐富，具有很多與國外豬種不同的特征。如繁殖力強、抗逆性好、肉質(zhì)佳、性情溫順等；然而它們也具有生長緩慢、屠宰率偏低、背膘較厚、胴體瘦肉率低等劣勢［12］。因此，適當引入外源豬種如杜洛克、巴克夏等優(yōu)良公豬為父本，與中國地方豬作為母本進行雜交可以取長補短，具有明顯的商業(yè)化優(yōu)勢。目前，在我國商品豬的生產(chǎn)中，以杜洛克為父本，中國地方豬為母本生產(chǎn)雜交品種如杜陸豬、杜湘豬等已經(jīng)實現(xiàn)商業(yè)化。然而，雜交育種過程中也不可避免地存在性狀分離現(xiàn)象，其中毛色分離是最直觀典型的性狀變化之一，嚴重影響商品豬的一致性。

目前，研究較為清楚的一般遺傳規(guī)律是：黑色對紅色為不同程度的顯性遺傳，表現(xiàn)為完全顯性和不完全顯性兩種類型，我國多種黑豬對紅色為顯性遺傳，巴克夏的六白對我國黑豬為隱性［13］。然而，毛色遺傳較為復雜，不同品種毛色表型下的遺傳背景存在差異，因此，毛色之間的顯隱性關(guān)系存在變化。侯萬文等［14］發(fā)現(xiàn)巴克夏豬為父本和民豬雜交F1代出現(xiàn)黑色和花色毛色分離現(xiàn)象，黑色仔豬占54%，花色仔豬占46%，說明民豬的黑色對巴克夏的六白具有不完全顯性的特征。曾檢華等［15］發(fā)現(xiàn)巴克夏豬為父本與陸川豬、萊蕪豬、圩豬、湘西黑豬雜交，F(xiàn)1代出現(xiàn)黃毛的比例為0%、9.02%、17.37%、8.69%，說明萊蕪豬、圩豬、湘西黑豬的黑毛對巴克夏的六白為不完全顯性，陸川豬黑毛對巴克夏的六白為完全顯性；杜洛克與陸川豬、湘西黑豬、圩豬、萊蕪豬雜交后代中，F(xiàn)1代出現(xiàn)紅毛比例分別為0%、11.12%、10.56%、7.43%，即表現(xiàn)為萊蕪豬、圩豬、湘西黑豬的黑毛對杜洛克的紅毛為不完全顯性，而陸川豬黑毛對杜洛克紅毛為完全顯性。劉健等［16］統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在1206頭F1代杜湘豬中黑色毛個體占68.49%、紅毛個體占20.32%、隱條色毛的個體占11.19%，黑色對紅毛表現(xiàn)為不完全顯性。

正常情況下，杜陸豬等表現(xiàn)為全黑［15］，黑色對紅色表現(xiàn)為完全顯性；而在實際生產(chǎn)過程中，杜陸豬群里中出現(xiàn)少量的毛色分離現(xiàn)象，部分個體毛色為紅色。本試驗從分子生物學角度，采用MC1R基因型分析杜陸豬毛色分離的原 因，發(fā)現(xiàn)對照樣本中，母本陸川豬基因型為ED1/ ED1，F(xiàn)1代杜陸豬均為黑毛，基因型為ED1/e；試驗樣本中，母本陸川豬均為雜合子ED1/e，因此，雜合子陸川豬母本和杜洛克父本雜交產(chǎn)生MC1R基因型表現(xiàn)為純種杜洛克所特有的e/e，子代表現(xiàn)為紅毛，說明引起杜陸豬出現(xiàn)紅毛的原因是由于母本為雜合子，而并非由雜交試驗所認為的黑色對紅色的顯隱性關(guān)系所決定的。通過本次實驗，可以對陸川豬黑毛對杜洛克紅毛具有完全顯性作一個側(cè)面驗證，同時，可以指導豬場以MC1R基因作為分子標記快速純化陸川豬基礎(chǔ)群。

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（責任編輯 崔建勛）

Analysis of MC1R genotype in F1hybrid of Duroc ×Luchuan Pig

QIN Ke1，ZENG Jian-hua2，XUE Ming3，SONG De-qing2，YANG Hong-jie3，HE Zu-yong1，LIU Xiao-hong1
（1. State Key Laboratory of Biocontrol，School of Life Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China；
2. Guangdong YIHAO Food Co.，Ltd.，Guangzhou 510620，China；
3. National Station of Animal Husbandry，Beijing 100125，China）

In order to explain the reason of coat color separation in the F1hybrid of Duroc ×Luchuan Pig populations，five litters of piglets with black coat color and the sows were studied as controls，by sequencing of PCR products，we analysed the genotype of MC1R gene in four litters of piglets with coat color separation and the sows. Sequencing results indicated that the MC1R genotype in piglets of control samples was ED1/e，and in the sows was ED1/ ED1；among the four litters of piglets with coat color separation and the sows，the MC1R genotype of black piglets，red piglets and the sows were ED1/e，e/e，ED1/e，respectively. The MC1R genotype in purebred Duroc is e/e and the purebred Luchuan pig is ED1/ ED1，the F1hybrid should be ED1/e. So the results confirmed that the sows farrowing red piglets were heterozygous and infiltrated by Duroc descent. From this study，we revealed the reason for coat color separation of Duroc ×Luchuan Pig populations from the molecular level. According to the coat color of piglets，we can quickly eliminate the heterozygous Luchuan sows.

Doroc；Luchuan pig；Dulu pig；coat color separation；MC1R gene

S813.3；Q346+.4

A

1004-874X（2017）01-0122-06

2016-12-13

國家科技基礎(chǔ)性工作專項（2014FY120800）；廣東省科技計劃項目（2014B020202001）；廣東省揚帆計劃項目（2014YT02H042）；廣東省自然科學基金（2016A030313310）；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2016ZX 08006003-006）

秦珂（1989-），男，在讀碩士生，E-mail：949612306@qq.com

劉小紅（1970-），男，博士，研究員，E-mail：liuxh8@mail.sysu.edu.cn

秦珂，曾檢華，薛明，等. 杜洛克×陸川豬雜交F1代MC1R基因型分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（1）：122-127.