湯鳴強(qiáng)，陳淑賢

（福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建 福清 350300）

三唑磷農(nóng)藥降解酶的定位及酶學(xué)性質(zhì)研究

湯鳴強(qiáng)，陳淑賢

（福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建 福清 350300）

采用超聲波破碎法破碎三唑磷農(nóng)藥降解菌芽孢桿菌TAP-1，研究不同細(xì)胞組分對(duì)三唑磷農(nóng)藥的降解率，應(yīng)用液相色譜法研究三唑磷農(nóng)藥降解酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，胞外酶、胞間粗酶液和胞內(nèi)酶對(duì)三唑磷的降解率分別為2.8（±0.34）%、12.8（±2.44）%和84.4（±6.71）%。菌株TAP-1降解三唑磷農(nóng)藥的主要活性物質(zhì)位于降解菌細(xì)胞內(nèi)，屬于胞內(nèi)酶組分。該酶最適作用pH值為6.5～7.0，在pH 5.0～7.5之間，酶活力均能保持在最高酶活力的68%以上。最適反應(yīng)溫度為30℃，在25～40℃溫度范圍內(nèi)能保持75%以上的降解活性。不同化學(xué)試劑和金屬離子對(duì)酶活性產(chǎn)生不同的影響。巰基修飾劑、EDTA、Hg2+和Mn2+對(duì)酶活性有抑制作用。Mg2+、Co2+和Fe3+對(duì)酶活性有促進(jìn)作用。該降解酶米氏常數(shù)（Km）為23.02 μmol/L，最大反應(yīng)速度（Vmax）為 0.738 μmol/mg·min。

三唑磷降解菌TAP-1；降解酶；酶定位；酶學(xué)特性

三唑磷（Triazophos，TAP）是1971年由原西德Farbwerke Hoechs公司開(kāi)發(fā)出來(lái)的高效、中毒、廣譜的有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)殺螨劑，對(duì)糧、棉、果、蔬菜等主要農(nóng)作物上的許多重要害蟲(chóng)如螟蟲(chóng)、稻飛虱、蚜蟲(chóng)、紅蜘蛛、棉鈴蟲(chóng)、菜青蟲(chóng)和線蟲(chóng)等有良好的防治效果。研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)有機(jī)磷農(nóng)藥相比，三唑磷表現(xiàn)為對(duì)水稻植株有很強(qiáng)的滲透性、對(duì)害蟲(chóng)有較高的胃毒活性和殺卵能力等特點(diǎn)［1］，因此，對(duì)常見(jiàn)的水稻危害害蟲(chóng)如二化螟和三化螟有較強(qiáng)的觸殺活力，從而被大量應(yīng)用于水稻害蟲(chóng)的防治，目前已成為長(zhǎng)江流域防治水稻螟蟲(chóng)的主打藥品［2］。我國(guó)于20世紀(jì)80年代中后期引入三唑磷農(nóng)藥。近年來(lái)，隨著甲胺磷等5種高毒有機(jī)磷農(nóng)藥被禁止生產(chǎn)與流通，三唑磷等農(nóng)藥的需求量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。目前，我國(guó)已成為三唑磷農(nóng)藥生產(chǎn)、使用及出口大國(guó)。

然而，隨著這類(lèi)農(nóng)藥的大量使用，其對(duì)生態(tài)環(huán)境與人類(lèi)健康的負(fù)面影響不容忽視。已有文獻(xiàn)報(bào)道，三唑磷對(duì)蜜蜂和多數(shù)魚(yú)類(lèi)高毒，對(duì)土壤微生物生態(tài)等也造成了一定的危害［3］。高濃度的三唑磷還可能具有較強(qiáng)的誘變效應(yīng)。近年來(lái)，我國(guó)部分養(yǎng)殖海域采用三唑磷作為清埕殺菌和消除蟲(chóng)害的常用農(nóng)藥，直接導(dǎo)致了它通過(guò)地表徑流進(jìn)入水體，從而對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)造成威脅。此外，三唑磷在水稻害蟲(chóng)防治上的大量使用也導(dǎo)致了稻米中三唑磷殘留量的增加。還有研究發(fā)現(xiàn)，三唑磷進(jìn)入水體環(huán)境后，由于藻類(lèi)的累積作用，可通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移到上一個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康有更大的風(fēng)險(xiǎn)［4］。

微生物是生物修復(fù)的重要資源，利用微生物及其產(chǎn)生的降解酶處理環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，已顯示出良好的應(yīng)用前景，是近年來(lái)研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解的主要發(fā)展方向［5］。大多數(shù)微生物降解農(nóng)藥的反應(yīng)屬于酶促反應(yīng)，降解酶的農(nóng)藥處理技術(shù)具有成本低、效果好、無(wú)二次污染、不會(huì)受到土著微生物排斥等特點(diǎn)，已被用于殺蟲(chóng)劑和除草劑的處理［6-7］。目前在農(nóng)藥酶降解領(lǐng)域研究比較廣泛的是菊酯類(lèi)農(nóng)藥、三氮苯類(lèi)農(nóng)藥和有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥等［8-10］。盡管?chē)?guó)內(nèi)外學(xué)者從不同環(huán)境中分離到許多有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌，但是，有關(guān)三唑磷農(nóng)藥微生物降解的研究還少見(jiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)外已分離的三唑磷降解菌主要有蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）和伯雷克氏菌（Klebsiella sp.）等［1，11］，主要研究了這些菌株的降解特性及降解途徑等，鮮見(jiàn)對(duì)三唑磷降解酶的研究。

本課題從福建建甌福農(nóng)生化有限公司污水處理池活性污泥及其出水口污泥中，通過(guò)富集培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)分離到5株對(duì)三唑磷農(nóng)藥有較高降解率的細(xì)菌菌株，采用生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合16S rDNA序列比對(duì)的方法將降解率最高的菌株鑒定為芽孢桿菌TAP-1（Bacillus sp. TAP-1），通過(guò)室內(nèi)搖瓶發(fā)酵法確定菌株的生長(zhǎng)與降解特性（另文發(fā)表）。本試驗(yàn)采用液相色譜技術(shù)，分析TAP-1菌株三唑磷降解酶成分在細(xì)胞中的位置，并研究降解酶的酶學(xué)性質(zhì)，為降解酶的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，也為有機(jī)磷農(nóng)藥污染的生物治理提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：芽孢桿菌TAP-1 （Bacillus sp. TAP-1），在Genbank上的注冊(cè)登錄號(hào)為HQ156466。

主要試劑：三唑磷（Triazophos，純度＞98%）購(gòu)自上海市農(nóng)藥研究所。甲醇（色譜純）購(gòu)自德國(guó)Merck公司。種子液培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，KH2PO41.0 g，去離子水1L，pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g，胰蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖5.0 g，去離子水1 L，pH 7.0～7.2。

主要儀器：L-2000日立高效液相色譜儀，配有L-2400紫外檢測(cè)器，L-2130 蠕動(dòng)泵；色譜柱：Apollo-C8 （250×4.6 mm，i.d.，5μm）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C-1臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器：太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠；UV-9100紫外分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；SCIENTE-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；105810R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；ALPHAI-2冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 降解菌的培養(yǎng)與降解酶的提取

取活化的TAP-1菌株于100 mL種子液培養(yǎng)基中，32℃、180 r/min培養(yǎng)16 h，15℃，8 000 r/min離心5 min，收集菌體，用pH 7.5、0.2 mmol/L Tris-HCl洗滌3次，用滅菌的雙蒸水重懸菌體，調(diào)整OD600≈2.0，按2%的接種量（V/ V）轉(zhuǎn)接到100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃、180 r/min培養(yǎng)72 h。

經(jīng)培養(yǎng)的菌液離心后用pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl洗滌3次，按照菌體：緩沖液=1∶4的比例將菌體懸浮于pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，混合均勻后置于冰浴中用超聲波處理15 min，功率為280 W，頻率為破碎4 s，間隔9 s，4℃、11 000 r/min離心10 min，除去細(xì)胞碎片得降解酶粗酶液。

1.3 酶活性測(cè)定

在860 μL pH 7.2、20 mmol /L Tris-HCl緩沖溶液中加入50 μL 500 mg/L三唑磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，37℃水浴預(yù)熱10 min，加入50 μL預(yù)熱的粗酶液，100 r/min水浴反應(yīng)1 h，用40 μL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)，每處理重復(fù)3次，以50 μL 上述緩沖液代替酶液為對(duì)照，計(jì)算降解酶活力。酶活力單位定義為：在37℃，pH 7.2條件下，每分鐘降解1 μmol三唑磷的酶用量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

在不同溫度、pH及不同化學(xué)物質(zhì)下檢測(cè)酶對(duì)三唑磷的降解效率，獲得降解酶的最適反應(yīng)溫度、最適作用pH及金屬離子化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活性的影響。取三唑磷溶液（濃度為20 mg/L）于離心管中，在不同溫度（分別為20、25、30、35、40、45和50℃）、pH （5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）、金屬離子（Fe3+、Zn2+、Hg2+、Co2+、Mg2+、Mn2+）及化學(xué)試劑（十二烷基硫酸鈉、巰基乙醇、吲哚乙酸、二硫赤蘚糖醇、乙二胺四乙酸、特里通、谷胱甘肽、碘乙酸、對(duì)氯高汞苯甲酸、N-乙基馬來(lái)酰亞胺）下進(jìn)行酶促反應(yīng)，分別測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，其他條件下的酶活力與之相比得各自相對(duì)酶活力。

將酶液在pH 7.2、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，于-20、4、20、30、40、50和60℃條件下處理1 h，測(cè)定剩余酶活力。將菌體分別懸浮在pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、 9.5、10.0、10.5和11.0的緩沖液（pH 5.0～6.5用40 mmol/L Na2HPO4-0.1mol/L檸檬酸緩沖液，pH 7.0～8.5用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 9.0～11.0用40 mmol/L 甘氨酸-NaOH緩沖液）中，于超聲波破碎后得到的粗酶液32℃保溫1 h后，分別測(cè)定其在pH 7.2、32℃下的剩余酶活力。最適條件下酶活力定義為100%，推算出其他條件下的相對(duì)酶活力，研究三唑磷降解酶對(duì)溫度的耐受性和pH穩(wěn)定性。

將不同濃度三唑磷（200、250、300、350、450 和500 mg/L）作底物，加入到pH 7.2、20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液體系中，32℃下反應(yīng)測(cè)定酶反應(yīng)速度，運(yùn)用Lineweaver-Burk作圖法求米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vmax）。

1.5 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

粗酶液的蛋白含量按Bradford法測(cè)定［12］，以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.6 三唑磷濃度的測(cè)定

取三唑磷降解液5 mL，4℃，8 000 r/min離心10 min得上清液。取上清液2 mL，用3×2 mL二氯甲烷液-液分配萃取2 h，取下層有機(jī)相風(fēng)干后加入等量甲醇供HPLC分析。HPLC工作條件為流動(dòng)相：甲醇：水=80：20；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；時(shí)間：15 min；保留時(shí)間：約5.89 min。

用Excel 2003和SPSS 15.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性分析采用LSD多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株TAP-1三唑磷降解酶的定位

微生物農(nóng)藥降解酶的分布可能在胞內(nèi)，也可能在胞膜或胞外［13］。近年國(guó)內(nèi)報(bào)道的一些有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶主要是胞內(nèi)酶［14-15］。以濃度為40 mg/L的三唑磷為底物分別測(cè)定不同粗酶液對(duì)三唑磷的降解率。結(jié)果（圖1）表明，菌株TAP-1發(fā)酵后細(xì)胞不同部位提取液對(duì)三唑磷的降解率差異顯著。菌株TAP-1胞外粗酶液、胞間粗酶液和胞內(nèi)粗酶液對(duì)三唑磷的降解率分別為2.8（±0.34）%、12.8（±2.44）%和84.4（±6.71）%，胞外和胞間粗酶液酶活明顯低于胞內(nèi)粗酶液。說(shuō)明菌株TAP-1三唑降解酶屬于胞內(nèi)蛋白組分。

圖1 細(xì)菌TAP-1三唑磷降解酶的定位

2.2 最適酶促反應(yīng)溫度的確定

溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度影響很大，在最適溫度范圍內(nèi)，降解酶活力最大，酶促反應(yīng)速度最快。圖2表明，溫度為30℃時(shí)，降解酶表現(xiàn)出最強(qiáng)的降解活性，即該降解酶對(duì)三唑磷的最適降解溫度為30℃。在25～40℃溫度范圍內(nèi)該降解酶均具有較好的降解活性，粗酶活力都能保持最高活力的75%以上，顯示了該酶對(duì)溫度的較好適應(yīng)性。但在50℃時(shí)，酶活性迅速降低，降低到最高酶活力的10.8%。

圖 2 溫度對(duì)三唑磷酶促降解的影響

2.3 最適酶促反應(yīng)pH的確定

圖 3 pH對(duì)三唑磷酶促降解的影響

由圖3可知，不同酸堿條件對(duì)粗酶活性有較大影響。粗酶降解三唑磷的最適pH值范圍為6.5～7.0，在pH 5.5～7.5之間粗酶能保持最高活力的68%以上，但pH＞7.5時(shí)，粗酶活力有明顯下降的趨勢(shì)。

2.4 金屬離子及有機(jī)試劑對(duì)酶的影響

不同的金屬離子和有機(jī)試劑會(huì)對(duì)酶組分產(chǎn)生不同的影響，從而促進(jìn)或抑制酶的作用。試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，巰基修飾劑如巰基乙醇（Mercaptoethanol）、碘乙酸（IAA）、對(duì)氯高汞苯甲酸（PCMB）、N-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用，表明巰基基團(tuán)可能涉及到酶的活性中心。EDTA對(duì)酶活的影響也較大，是因?yàn)镋DTA是一種絡(luò)合劑，可與金屬離子形成絡(luò)合物。已報(bào)道的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶多數(shù)為金屬酶，加入EDTA會(huì)與酶活性中心的金屬離子螯合，從而降低了酶的活性。不同的金屬離子對(duì)酶的活性產(chǎn)生不同的影響。Mg2+和Co2+對(duì)酶活有明顯的激活作用；Fe3+對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用；而Hg2+和Mn2+對(duì)該酶活有強(qiáng)烈的抑制作用，其他金屬離子和有機(jī)溶劑對(duì)酶活無(wú)明顯影響。

2.5 三唑磷降解酶對(duì)溫度的耐受性

從圖4可以看出，粗酶在-20℃和4℃時(shí)保存最為穩(wěn)定，處理1 h后粗酶仍能保持最高酶活力的98%左右。粗酶活力隨著保存溫度的升高而降低，20℃下處理1 h與30℃下處理1 h酶活力分別保持原有酶活力的85.5%和83.3%，二者間沒(méi)有顯著差異。之后，粗酶活力隨著保存溫度的進(jìn)一步升高而呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)。40℃、50℃和60℃下處理1 h，粗酶活力分別下降到最高活力的61.3%、34.5%和11.2%，與低中溫處理差異顯著。可見(jiàn)，溫度對(duì)粗酶活性的影響較大，較高的溫度可使降解酶變性失活。

表1 各種化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活力的影響

圖 4 粗酶對(duì)溫度的耐受性

2.6 粗酶的pH穩(wěn)定性

圖5表明，用pH為6.5～7.5的緩沖體系處理酶液1 h后，粗酶的剩余酶活力保持90%以上，在pH為8.0的緩沖體系中保存1 h后，酶活力損失不到40%，而在pH為8.5的環(huán)境中保存1 h后，酶活力損失近77%。之后，隨著緩沖體系pH的升高，粗酶液的剩余酶活力進(jìn)一步下降，直至為0。

圖 5 粗酶對(duì)pH的耐受性

2.7 三唑磷降解酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)

動(dòng)力學(xué)常數(shù)可以反映酶與底物的關(guān)系，是區(qū)別不同反應(yīng)底物的重要特征性常數(shù)。用pH 7.2、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)三唑磷溶液使之濃度為200、250、300、350、450 和500 mg/L，在32℃水浴中預(yù)熱10 min后加入50 μL酶液，32℃、100 r/min條件下反應(yīng)30 min，以不加粗酶液作為對(duì)照，計(jì)算反應(yīng)體系中三唑磷的降解速度，以三唑磷濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作Lineweaver-Burk圖。結(jié)果（圖6）表明，三唑磷降解酶米氏常數(shù)為23.02 μmol/L，最大反應(yīng)速度為 0.738 μmol/ mg·min。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在波長(zhǎng)595 nm下比色測(cè)定，測(cè)得粗酶液中可溶性蛋白含量為2.31 g/L。因此，粗酶對(duì)三唑磷的最大降解速率為0.319 μmol/mg·min。

圖 6 三唑磷降解酶的Lineweaver-burk 圖

3 結(jié)論與討論

微生物酶制劑在生物修復(fù)方面的成功與否是由多種因素決定的，農(nóng)藥降解酶與所有酶蛋白一樣，對(duì)于環(huán)境條件很敏感。其中，環(huán)境溫度、pH及重金屬離子的種類(lèi)與濃度等是影響酶制劑作用效果的重要因素。試驗(yàn)結(jié)果表明，施氏假單胞菌J7-4 （Pseudomonas stutzeri）有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶為胞內(nèi)酶，最適pH為9.0，最適反應(yīng)溫度為45℃。Mg2+、Ca2+等金屬離子對(duì)其有激活作用，而Mn2+、Fe3+、Zn2+、Al3+、Hg+、Cd2+、Ba2+和Ag+對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用［14］。黑曲霉ZHY256樂(lè)果降解酶的最適作用溫度與pH分別為50℃、7.0，pH 穩(wěn)定范圍為6.0～9.5［16］。有機(jī)磷降解酶OPHC2降解甲基對(duì)硫磷的最適溫度為65℃，最適pH為9，該酶具有很好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，并且對(duì)大多數(shù)金屬離子和化學(xué)試劑不敏感［17］。源自真菌的甲基對(duì)硫磷和內(nèi)吸磷降解酶為胞內(nèi)酶，酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，最適pH 7.5，在50℃以下、pH 6.0～9.5范圍內(nèi)活性穩(wěn)定［18］。同樣為胞內(nèi)酶的毒死蜱降解酶具較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度為40℃，最適作用pH值為 6.8［19］。

本試驗(yàn)對(duì)三唑磷降解酶最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH以及粗酶液的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性分別進(jìn)行了研究，為降解酶制劑的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。試驗(yàn)表明，三唑磷降解酶的最適作用溫度為30℃，最適作用pH范圍為6.5～7.0，pH≥8.0時(shí)，粗酶活力有明顯下降的趨勢(shì)。Co2+對(duì)酶活有明顯的激活作用，進(jìn)一步說(shuō)明了Co2+可能作為三唑磷降解酶輔酶成分。表面活性劑Triton-100通過(guò)改善細(xì)胞表面通透性，促使酶活性的增加。Hg2+、Mn2+、EDTA以及巰基乙醇等巰基修飾劑強(qiáng)烈抑制酶的活性，表明巰基基團(tuán)可能涉及到酶的活性中心。動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值和Vmax體現(xiàn)了酶與底物結(jié)合的牢固程度和酶的特異性質(zhì)，對(duì)于研究酶的生理生化功能和催化方向有重要的指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)以三唑磷為底物，得到米氏常數(shù)為23.02 μmol/L，最大反應(yīng)速率為0.738 μmol/mg·min，為進(jìn)一步研究三唑磷降解酶的酶學(xué)性質(zhì)提供了理論依據(jù)。

同已有報(bào)道的有機(jī)磷降解酶相比，本研究從芽孢桿菌TAP-1中提取的粗酶在酶學(xué)特性上存在差異，這可能與菌株的遺傳性差異、農(nóng)藥本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)特性以及酶促反應(yīng)體系不同有關(guān)。為了進(jìn)一步闡明該酶的作用機(jī)理，有必要開(kāi)展酶的分離純化工作，并且通過(guò)固定化和添加酶活性保護(hù)劑等方法，為降解酶的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Distribution and properties of triazophos-degrading enzyme

TANG Ming-qiang，CHEN Shu-xian
（School of Ocean and Biochemical Engineering, Fuqing Branch of Fujian Normal University, Fuqing 350300, China）

To investigate the effects of different fractions of bacterial strain Bacillus TAP-1 on the degradation rate of tirazophos, sonication method was applied to lyse the TAP-1 cells to obtain triazophos-degrading enzyme，while HPLC（High Performance Liquid Chromatography）method was used to determine the enzymatic properties. The results showed that the degradation rate of triazophos by intracellular, intercellular and extracellular extracts were 84.4（±6.71）%, 12.8（±2.44）%, and 2.8（±0.34）%, respectively. The active substances of triazophos-degrading were intracellular fractions. The enzyme demonstrated greatest enzymatic activity in the pH range of 6.5-7.0 with its highest activity occurring in the pH range of 5.0-7.5. Enzymatic activity occurred at an optimum temperature of 30℃ for the degradation of triazophos；activity remained above 75% of the maximum over a temperature range of 25℃-40℃. Different chemicals and metallic ions also had different effects on its activity. Its activity can be strongly inhibited by thiol modifier, ETDA, Hg2+and Mn2+, but stimulated by Mg2+，Co2+and Fe3+. The Km value and the maximal degradation rate of triazophos-hydrolase were 23.02 μmol/L and 0.738 μmol/mg·min, respectively.

triazophos-degrading bacteria TAP-1；degrading enzyme；enzyme localization；enzymatic property

X592

A

1004-874X（2017）-01-0115-07

2016-10-11

福建省自然科學(xué)基金（2012J01118）

湯鳴強(qiáng)（1966-），男，博士，教授，E-mail：mqt-1022@163.com

湯鳴強(qiáng)，陳淑賢. 三唑磷農(nóng)藥降解酶的定位及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（1）：115-121.