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        田間煙蚜種群對(duì)3種殺蟲(chóng)劑抗性與酶活性關(guān)系的研究

        2017-03-31 01:10:58劉童童楊茂發(fā)
        廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期

        張 超,劉童童,2,楊 洪,3,王 召,4,楊茂發(fā),3

        (1.貴州大學(xué)昆蟲(chóng)研究所,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院,貴州 貴陽(yáng) 550000;3.貴州大學(xué)煙草學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;4.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院,貴州 凱里 556011)

        田間煙蚜種群對(duì)3種殺蟲(chóng)劑抗性與酶活性關(guān)系的研究

        張 超1,劉童童1,2,楊 洪1,3,王 召1,4,楊茂發(fā)1,3

        (1.貴州大學(xué)昆蟲(chóng)研究所,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院,貴州 貴陽(yáng) 550000;3.貴州大學(xué)煙草學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;4.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院,貴州 凱里 556011)

        為了探討煙蚜對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性與酶活關(guān)系,就田間煙蚜種群對(duì)樂(lè)果、滅多威和阿維菌素3種殺蟲(chóng)劑的抗性與酶活性的關(guān)系進(jìn)行研究。對(duì)具有不同抗性水平的幾個(gè)田間煙蚜種群的酶活性測(cè)定結(jié)果顯示:抗樂(lè)果、滅多威、阿維菌素品系中AchE、GSTs和CAT 3種酶的活性都高于敏感品系,其中抗樂(lè)果的興仁和湄潭抗性品系A(chǔ)chE酶活性為敏感品系的1.212、1.588倍,GSTs酶活性為敏感品系的1.625、1.900倍,CAT酶活性是敏感品系的1.439、2.018倍;抗滅多威品系的清鎮(zhèn)和湄潭抗性品系A(chǔ)chE酶活性為敏感品系的1.078、1.647倍,GSTs酶活性為敏感品系的 1.142、1.935倍,CAT酶活性為敏感品系的1.142、1.935倍;抗阿維菌素的興仁和長(zhǎng)順抗性品系A(chǔ)chE 酶活性為敏感品系的1.370、1.664倍,GSTs酶活性為敏感品系的1.830、2.318倍,CAT酶活性為敏感品系的1.800倍、3.708倍。研究結(jié)果可為闡明田間煙蚜種群抗性產(chǎn)生機(jī)制提供參考。

        煙蚜;抗藥性;酶活性;乙酰膽堿酯酶;過(guò)氧化氫酶;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶

        煙蚜Myzus persicae(Sulzer)又名桃蚜,屬半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphidiade)瘤蚜屬(Myzus),是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),更是煙草的主要害蟲(chóng)。煙蚜除吸取煙株汁液引起植株?duì)I養(yǎng)不良及生長(zhǎng)畸形造成直接危害外,還可傳播煙草黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)等多種煙草病毒病,對(duì)煙草造成更為嚴(yán)重的間接危害[1]。目前,在田間對(duì)煙蚜的綜合治理中以化學(xué)防治為主,這也是農(nóng)民選擇的首要手段。但殺蟲(chóng)劑不合理使用和施藥器械落后等原因使得煙蚜長(zhǎng)期處于高選擇和高殘留環(huán)境中,加上煙蚜具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和較短的生活史,敏感性快速減弱,耐藥性問(wèn)題亦日趨嚴(yán)重[2]。酶(Enzyme)是一類具有特定催化活性的蛋白質(zhì),昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)幾乎都伴隨著酶的反應(yīng)。因此,對(duì)生物的酶系進(jìn)行研究不僅對(duì)闡明生物生命現(xiàn)象的本質(zhì)十分重要,也是闡明生物對(duì)逆境產(chǎn)生適應(yīng)性機(jī)制的核心[3-4]。過(guò)去的研究表明,逆境脅迫下昆蟲(chóng)體內(nèi)的主要酶系其活性和含量都會(huì)發(fā)生變化,這是昆蟲(chóng)抗性形成的重要生化機(jī)制[5]。郭天鳳等和宋春滿等對(duì)煙蚜的研究結(jié)果表明具有不同抗性水平煙蚜室內(nèi)種群體內(nèi)解毒酶活力有較大差異[6-8],王澤華等和張鵬等對(duì)昆蟲(chóng)的研究結(jié)果也顯示,不同齡期昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑敏感性不同[9-10]。蟲(chóng)態(tài)和殺蟲(chóng)劑敏感性水平是煙蚜防治適期選擇、提高殺蟲(chóng)劑防效、治理和延緩耐藥性的重要依據(jù)。

        貴州省主要煙區(qū)的田間煙蚜種群已對(duì)樂(lè)果、滅多威和阿維菌素已產(chǎn)生低倍抗性[11]。本研究以田間煙蚜抗性種群為研究對(duì)象,測(cè)定已對(duì)樂(lè)果、滅多威和阿維菌素產(chǎn)生抗性的田間煙蚜種群體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶(AChE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的變化,探索煙蚜對(duì)這3類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗藥性的生化機(jī)制,并對(duì)二者間關(guān)系進(jìn)行分析,旨在為貴州煙區(qū)煙蚜的田間有效防控和耐藥性管理提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        1.1.1 供試蟲(chóng)源及飼養(yǎng)方法 相對(duì)敏感品系的煙蚜種群:采自長(zhǎng)順縣馬路鄉(xiāng)煙葉生產(chǎn)基地,在不接觸任何藥劑的情況下已在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)5年。飼養(yǎng)條件:溫度:25(±1)℃、相對(duì)濕度:60%~70%、光周期14L∶10D。

        抗性品系的煙蚜種群:選取對(duì)樂(lè)果具有抗性的兩個(gè)田間煙蚜種群:湄潭抄樂(lè)煙蚜種群(對(duì)樂(lè)果抗性倍數(shù)為6.946倍)、興仁四聯(lián)煙蚜種群(對(duì)樂(lè)果抗性倍數(shù)為3.214倍),選取對(duì)滅多威具有抗性的兩個(gè)田間煙蚜種群:湄潭抄樂(lè)煙蚜種群(對(duì)滅多威抗性倍數(shù)為5.05倍)、清鎮(zhèn)流長(zhǎng)煙蚜種群(對(duì)滅多威抗性倍數(shù)為2.616倍),選取對(duì)阿維菌素具有抗性的兩個(gè)田間煙蚜種群:長(zhǎng)順改堯煙蚜種群(對(duì)阿維菌素抗性倍數(shù)為6.043倍)、興仁四聯(lián)煙蚜種群(對(duì)阿維菌素抗性倍數(shù)為2.952倍),以上煙蚜種群均于2013年7月采自貴州省煙田。

        1.1.2 供試儀器 電子分析天平,德國(guó)Sartorious公司;電熱恒溫水溫箱,北京永光明醫(yī)療儀器廠;電熱鼓風(fēng)干燥箱101-OA型,天津市泰斯特儀器有限公司;Haier冰箱,海爾集團(tuán);酶標(biāo)儀,奧地利Tecan公司;試管、容量瓶等其他儀器均為國(guó)產(chǎn);Sigma-3K30 高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Sartorious公司;移液槍,大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司;自動(dòng)雙純水系統(tǒng)purelab plus p15123,Pall Comp(USA)公司;RGX250人工培養(yǎng)箱,天津市泰斯特儀器有限公司;755型紫外分光光度計(jì)。移液器 2.5、10、100、200、1000 μL,大龍興創(chuàng)試驗(yàn)儀器(北京)有限公司50~300 μL八孔道移液器,大龍醫(yī)療設(shè)備(上海)有限公司

        1.1.3 主要試劑 BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;乙酰膽堿酯酶測(cè)試盒,南京建成科技有限公司;谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒,南京建成科技有限公司;過(guò)氧化氫酶(Catalase CAT)測(cè)試盒,南京建成科技有限公司;氯化鈉注射液(0.9%),貴州科倫藥液有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 酶液制備 分別取煙蚜敏感種群、湄潭抄樂(lè)煙蚜種群和興仁四聯(lián)煙蚜種群無(wú)翅成蚜10頭,加入900 μL的生理鹽水,用玻璃勻漿器置冰上勻漿,4℃條件下3 000 r/min離心10 min,取上清液為酶源液。

        1.2.2 酶源蛋白含量測(cè)定 配制BCA工作液:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量,按50體積試劑A,1體積試劑B配制適量BCA工作液,充分混勻。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、6、8、10μL加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中,加滅菌雙蒸水補(bǔ)足到10μL;取10μL待測(cè)樣品加入96孔板。每個(gè)測(cè)定3次重復(fù)。向待測(cè)樣品孔和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入200μL BCA工作液混勻。60℃溫浴30 min,冷卻至室溫。

        酶標(biāo)儀562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為X軸,OD值為Y軸,制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)各樣品的OD值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。

        1.2.3 酶活性測(cè)定 乙酰膽堿酯酶(AchE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和過(guò)氧化氫酶(CAT)3種酶的活性均采用南京建成科技有限公司的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

        采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 煙蚜對(duì)樂(lè)果的抗性與酶活性的關(guān)系

        測(cè)定敏感品系煙蚜和田間抗樂(lè)果品系體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化氫酶活性,結(jié)果(表1)表明,興仁煙蚜與湄潭煙蚜品系均高于敏感品系體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶,比值分別為1.212和1.588。煙蚜體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定結(jié)果顯示,湄潭煙蚜品系最高,為敏感品系煙蚜的1.90倍,興仁煙蚜品系較低為1.625倍。同理,興仁煙蚜與湄潭煙蚜品系的過(guò)氧化氫酶活性分別是相對(duì)敏感品系的1.439倍和2.018倍。由此可見(jiàn),隨著3個(gè)煙蚜種群抗性水平的增加,其體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化氫酶3種酶活性均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。表明煙蚜對(duì)樂(lè)果產(chǎn)生抗性后,其體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的活性增強(qiáng)。

        表1 抗樂(lè)果煙蚜種群的3種酶活性比較

        2.2 煙蚜對(duì)滅多威的抗性與酶活性的關(guān)系

        測(cè)定敏感品系煙蚜和田間抗滅多威品系體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化氫酶活性,結(jié)果(表2),清鎮(zhèn)煙蚜與湄潭煙蚜品系均高于敏感品系體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶,比值分別為1.078和1.641。煙蚜體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定結(jié)果顯示,湄潭煙蚜品系最高,為敏感品系煙蚜的1.935倍,興仁煙蚜品系較低為1.142倍。同理,興仁煙蚜與湄潭煙蚜品系的過(guò)氧化氫酶活性分別是相對(duì)敏感品系的1.553倍和2.456倍。由此可見(jiàn),隨著3個(gè)煙蚜種群抗性水平的增加,其體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化氫酶3種酶活性均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。表明煙蚜對(duì)滅多威產(chǎn)生抗性后,其體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的活性增強(qiáng)。

        表2 抗滅多威煙蚜種群的3種酶酶活性比較

        2.3 煙蚜對(duì)阿維菌素的抗性與酶活性的關(guān)系

        測(cè)定敏感品系煙蚜和田間抗阿維菌素品系體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化氫酶活性,結(jié)果(表3)表明,興仁煙蚜與長(zhǎng)順煙蚜品系均高于敏感品系體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶,比值分別為1.370和1.664。煙蚜體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定結(jié)果顯示,長(zhǎng)順煙蚜品系最高,為敏感品系煙蚜的2.318倍,興仁煙蚜品系較低為1.830倍。同理,興仁煙蚜與湄潭煙蚜品系的過(guò)氧化氫酶活性分別是相對(duì)敏感品系的1.800倍和3.708倍。由此可見(jiàn),隨著3個(gè)煙蚜種群抗性水平的增加,其體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化氫酶3種酶活性均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。表明煙蚜對(duì)阿維菌素產(chǎn)生抗性后,其體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶的活性增強(qiáng)。

        表3 抗阿維菌素?zé)熝练N群的3種酶酶活性比較

        3 討論

        害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗藥性是不斷適應(yīng)殺蟲(chóng)劑的過(guò)程。昆蟲(chóng)的一切生命活動(dòng)均有酶的參與,當(dāng)藥劑進(jìn)入蟲(chóng)體內(nèi),經(jīng)過(guò)體內(nèi)酶的氧化、還原、水解或結(jié)合后,降低其毒性,或增強(qiáng)其水溶性,將其排出體外,達(dá)到解毒目的[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)在殺蟲(chóng)劑的選擇壓力下,昆蟲(chóng)體內(nèi)解毒酶酶活性產(chǎn)生了相應(yīng)的變化,導(dǎo)致抗性昆蟲(chóng)中解毒酶酶活性有所增高,引起了害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性的產(chǎn)生[14]。李周直等用藥劑處理褐刺蛾和褐邊綠刺蛾后發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶的活性均高于敏感體系,推測(cè)昆蟲(chóng)體內(nèi)的保護(hù)酶的變化與產(chǎn)生抗藥性有很大的關(guān)系[15]。由此可見(jiàn)昆蟲(chóng)體內(nèi)酶活性的變化是昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性的原因之一。

        Smissaert首先在二斑葉螨Tetranychus urticae上發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致對(duì)殺蟲(chóng)劑不敏感的AChE變構(gòu)[16],隨后在許多種昆蟲(chóng)中如家蠅(Musca domestica)、按蚊(Anopheles)、小菜蛾(Plutella xylostella)和棉蚜(Aphis gossypii)等昆蟲(chóng)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了不敏感AChE的存在[17]。除了酶性質(zhì)發(fā)生改變外,昆蟲(chóng)也可通過(guò)AChE基因表達(dá)量的增加而對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性。在AChE所介導(dǎo)的抗性機(jī)理研究中,還有另一些原因如AChE活性的增加、AChE酶量的增加都可能與昆蟲(chóng)抗性水平成正比[18-19]。本研究通過(guò)對(duì)具有不同抗性水平的幾種煙蚜種群的乙酰膽堿酯酶活性測(cè)定結(jié)果顯示,部分抗性品系的AChE活性與敏感品系有顯著性差異,有的差異不顯著。但是隨著抗性提高,AChE的活性都有一定程度的提高。這可能與殺蟲(chóng)劑的種類有關(guān),大量的研究表明,AChE對(duì)有機(jī)磷和氨甲基酸酯類殺蟲(chóng)劑敏感性的降低是昆蟲(chóng)對(duì)這些殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)理之一。

        谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是昆蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的重要因素,在保護(hù)組織以抵御氧化侵害及氧化壓力中起重要作用。本研究中3種殺蟲(chóng)劑的抗性品系中,所有抗性煙蚜品系的GSTs的活性均顯著高于相對(duì),GSTs的活性明顯高于敏感品系煙蚜的GSTs活性,并且同一殺蟲(chóng)劑的抗性煙蚜品系之間,GSTs的活性亦達(dá)到顯著水平。抗性品系中GSTs活性提高,這在其他的抗性昆蟲(chóng)中也呈現(xiàn)相同的規(guī)律[20-21]。說(shuō)明GSTs可能是是昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的一個(gè)很重要的因素。

        過(guò)氧化氫酶作為生物體內(nèi)重要物質(zhì),具有非常重要的生理功能,其中最為主要的就是參與活性氧代謝過(guò)程。李周直等證明菜粉蝶、刺蛾體內(nèi)CAT與它們的耐藥性有關(guān)[15]。陳尚文認(rèn)為馬尾松毛蟲(chóng)體內(nèi)CAT與其耐藥性存在一定的相關(guān)性[22]。吳小鋒等發(fā)現(xiàn)家蠶血液CAT 與蠶體抗逆性有一定的相關(guān)性[23]。徐欣等用敵敵畏和高效氯氰菊酯殺蟲(chóng)劑在不同抗性選育方式下對(duì)家蠅抗藥性發(fā)展和CAT活性變化的作用,經(jīng)處理后CAT活性均有不同程度的增加[24]。在本實(shí)驗(yàn)中樂(lè)果和滅多威的抗性品系中,所有抗性煙蚜品系的CAT的活性均顯著高于相對(duì)敏感品系煙蚜的CAT活性,并且同一殺蟲(chóng)劑的抗性煙蚜品系之間,CAT的活性差異性亦達(dá)到顯著水平;在阿維菌素的抗性品系中,長(zhǎng)順煙蚜品系的CAT活性與其他兩個(gè)煙蚜品系的CAT活性差異顯著;相對(duì)敏感品系煙蚜的CAT活性與興仁煙蚜品系的CAT活性差異不顯著。

        本研究對(duì)具有不同抗性水平的田間煙蚜種群的酶活性進(jìn)行測(cè)定表明,對(duì)樂(lè)果、阿維菌素、滅多威具有抗性的煙蚜種群所測(cè)定的3種酶活性均比敏感品系高,由次可見(jiàn)當(dāng)煙蚜對(duì)藥劑抗性增強(qiáng)時(shí)煙蚜體內(nèi)的AchE、GSTs和CAT 3種酶的酶活性均比敏感品系高,而且酶活性隨著抗性的增強(qiáng)呈正相關(guān)關(guān)系。由于所選取的田間煙蚜種群對(duì)這3種殺蟲(chóng)劑的抗性都是低倍抗性或者只是敏感性降低。因此,需要繼續(xù)監(jiān)測(cè)這些煙蚜種群對(duì)殺蟲(chóng)劑抗性變化,進(jìn)一步研究以上3種酶的活性變化的分子機(jī)制,才能探明田間煙蚜種群對(duì)這3種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的機(jī)理,為田間煙蚜防控的用藥策略提供參考。

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        (責(zé)任編輯 楊賢智)

        Relationship between three insecticides resistance and enzyme activity in natural population of Myzus persicae(Sulzer)

        ZHANG Chao1,LIU Tong-tong1,2,YANG Hong1,3,WANG Zhao1,4,YANG Mao-fa1,3
        (1. Institute of Entomology,Guizhou University,Guiyang 550025,China;
        2. Guizhou Academy of Forestry Science,Guiyang 550000,China;
        3. College of Tobacco Science, Guizhou University,Guiyang 550025,China;
        4. School of Environment and Life Sciences,Kaili College,Kaili 556011,China)

        In order to explore the relationship between insecticide resistance and enzyme activity in natural population of Myzus persicae(Sulzer),we studied the activities of Ache,GST and CAT in M. persicae(Sulzer)insecticide resistance to dimethoate,methomyl and avermectins. The results showed that,the resistance stains(different regions)of dimethoate,methomyl and avermectins had higher enzyme activity of AchE,GSTs and CAT than susceptible strain. For the resistance stain of dimethoate,the enzyme activities of AchE in Xingren and Meitan resistant strain were 1.212 times,1.588 times than susceptible strain;the enzyme activities of GSTs resistant strain were 1.625 times,1.900 times than susceptible strain,and the enzyme activities of CAT resistant strain were 1.439 times and 2.018 times than susceptible strain. For the resistance strain of methomyl,the enzyme activities of AchE in Qingzhen and Meitan resistant strain were 1.078 times 1.647 times than susceptible strain;the enzyme activities of GSTs resistant strain were 1.142 times,1.935 times than susceptible strain,and the enzyme activities of CAT resistant strain were 1.142 times,1.935 times than susceptible strain. Forthe resistance strain of avermectins,the enzyme activities of AchE in Xingren,Changshun resistant strain were 1.370 times,1.664 times than susceptible strain;the enzyme activities of GSTs resistant strain were 1.830 times,2.318 times than susceptible strain,and the enzyme activities of CAT resistant strain were 1.800 times,3.708 times than susceptible strain. The results provide a reference for elucidating the field resistance mechanism of M. persicae(Sulzer)population.

        Myzus persicae;insecticide resistance;enzyme activity;AChE;CAT;GST

        S435.72

        A

        1004-874X(2017)01-0100-06

        2016-10-10

        中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目(201022)

        張超(1992-),男,在讀碩士生,E-mail:zc0178sfp@163.com

        楊洪(1975-),男,博士,教授,E-mail:agr.hyang@gzu.edu.cn

        張超,劉童童,楊洪,等. 田間煙蚜種群對(duì)3種殺蟲(chóng)劑抗性與酶活性關(guān)系的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,44(1):100-105.

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