陳煒，馮德云，李波，王穎

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要誘因之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有2億多人感染了HCV病毒，約占了世界人口的3.3%。HCV蛋白受宿主和病毒蛋白酶的作用被切割形成至少10種蛋白，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白（核心蛋白Core、包膜蛋白E1和E2，還有p7離子通道）和6種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤發(fā)生中的作用已日漸受到重視。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要表現(xiàn)形式，是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段，RASSF2通過(guò)啟動(dòng)子甲基化在多種腫瘤中失活[1-7]。它作為一種潛在的抑癌基因，具有促進(jìn)凋亡和細(xì)胞周期停滯及抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[8-9]。RASSF2有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別為RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C，僅RASSF2A轉(zhuǎn)錄本的啟動(dòng)子區(qū)有CpG島。研究表明，RASSF2A以GTP依賴的方式與K-RAS直接結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[8]，在肺癌、胃癌、乳腺癌及胰腺癌中存在RASSF2A啟動(dòng)子甲基化[1,10-11]。5-雜氮-2'-脫氧胞苷（5-aza-dC）是一種核苷酸類似物，可抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性，使DNA去甲基化，體外實(shí)驗(yàn)表明，5-aza-dC對(duì)胰腺癌、鼻咽癌、胃癌及結(jié)腸癌等多種細(xì)胞有顯著生長(zhǎng)抑制作用[12-15]，推測(cè)HCV蛋白可能是通過(guò)誘導(dǎo)RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而異常激活RAS信號(hào)通路，參與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。本研究觀察了分別表達(dá)NS3、Core、NS5A的QSG7701肝細(xì)胞株（NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701）中RASSF2 mRNA表達(dá)水平的改變，并探討RASSF2A啟動(dòng)子甲基化在HCV蛋白所致的肝細(xì)胞癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

穩(wěn)定表達(dá)Core、NS3的人源肝細(xì)胞系Core/QSG7701和NS3/QSG7701由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存；穩(wěn)定表達(dá)NS5A的人源肝細(xì)胞系NS5A/QSG7701由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院傳染科龔國(guó)忠教授惠贈(zèng)；其中L02細(xì)胞株購(gòu)自中南大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究室；RT-PCR試劑盒、DNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；EZDNA甲基化修飾試劑盒購(gòu)自天漠科技有限公司；5-aza-dC購(gòu)自Sigma公司；NS3、NS5A、β-Actin單克隆抗體以及Core多克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔和羊抗鼠均購(gòu)自中杉金橋；AnnexinV/PI雙染試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物；細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自七海復(fù)泰。RASSF2基因的PCR引物由上海生物工程有限公司合成（正義：CTA TGG CTC TGT CAC CAA CG，反義：GCT TCT GTT TCT CAC CAC TCG，長(zhǎng)度128 bp），GAPDH引物（正義：GTG AAC CAT GAG AAG TAT GAC AAC，反義：CAT GAG TCC TTC CAC GA TAC C，長(zhǎng)度123 bp）；RASSF2A啟動(dòng)子甲基化引物（正義：GTT CGT CGT CGT TTT TTA GGC G，反義：AAA AAC CAA CGA CCC CCG CG，長(zhǎng)度108 bp），RASSF2A啟動(dòng)子未甲基化引物（正義：AGT TTG TTG TTG TTT TTT AGG TGG，反義：AAA AAA CCA ACA ACC CCC ACA，長(zhǎng)度108 bp）。

1.2 主要方法

1.2.1 RT-PCR 按照細(xì)胞中提取RNA的步驟所示取出生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，用PBS清洗3次，1 mL的TRIzol試劑吹打，200 μL的三氯甲烷孵育5 min，500 μL的異丙醇孵育10 min，75%的乙醇吹打混勻，離心后靜置干燥5 min。加入10 μL的DEPC水，吹打混勻，取2 μL RNA樣本，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣本的濃度和純度，再根據(jù)TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所示配制基因組DNA去除的反應(yīng)液，共 10 μL，反應(yīng)條件為 42 ℃ 2 min，4 ℃存放。配制20 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，反應(yīng)條件為37 ℃15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃存放，根據(jù)康維世紀(jì)PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性 30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，72 ℃終延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后取出樣本，配制好2%的瓊脂糖凝膠，直接進(jìn)行電泳。

1.2.2 甲基化特異性PCR（MSP） 細(xì)胞培養(yǎng)好后取出，胰酶消化后，用1 mL的PBS吹打，離心后加入200 μL的PBS重懸細(xì)胞，根據(jù)TAKARA公司的全基因組DNA提取試劑盒所示，最終洗脫DNA，再取20 μL DNA按照天漠公司的甲基化修飾試劑盒所示加入CT Conversion Reagent，放到PCR儀上，設(shè)置程序?yàn)?8 ℃ 10min，64 ℃ 2.5 h，接著繼續(xù)按試劑盒所示最終洗脫DNA，按照康維世紀(jì)盒所示配制50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，設(shè)置反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增后取反應(yīng)產(chǎn)物，配制好2%的瓊脂糖凝膠后，進(jìn)行電泳。

1.2.3 Western blot 首先按步驟提取細(xì)胞中的總蛋白，準(zhǔn)備4 ℃離心機(jī)，用冰的PBS洗滌3次，每瓶細(xì)胞中加入100 μL的細(xì)胞裂解混合物，冰上裂解30 min，離心后得到蛋白，用BCA法測(cè)定樣本OD值，每管加入25 μL的標(biāo)準(zhǔn)品和200 μL已配制好的工作液，37 ℃孵育30 min，568 nm處測(cè)定OD值。然后每管加入22.5 μL的雙蒸水、2.5 μL的待測(cè)蛋白及200 μL的分析液，37 ℃孵育30 min，測(cè)OD值計(jì)算蛋白濃度，再按比例將蛋白與上樣緩沖液混合，沸水5 min，按步驟配好分離膠和積層膠后，將Maker、混合物和上樣緩沖液加入到凝膠孔中，連接電泳裝置，65 V電壓50 min，110 V電壓60 min，完畢后取出凝膠，配制好轉(zhuǎn)膜緩沖液，并加入甲醇，將凝膠和濾紙直接放入到轉(zhuǎn)膜緩沖液中，PDVF膜甲醇浸泡15 s，雙蒸水平衡5 min，放到轉(zhuǎn)膜緩沖液里。安裝三明治結(jié)構(gòu)，從下到上依次為濾紙→PVDF膜→凝膠→濾紙。15 V恒壓45 min。配制好封閉液，PVDF膜放到封閉液中，搖晃4 h。接著一抗孵育（搖床2 h，4 ℃冰箱過(guò)夜），TBST洗滌3次，每次10 min，二抗孵育4 h，TBST洗滌3次，每次10 min。打開顯像儀，設(shè)置曝光程序?yàn)槊?s曝光1次，共曝100張。

1.2.4 MTT 待細(xì)胞生長(zhǎng)良好后，PBS洗3次，胰酶消化吹打細(xì)胞并計(jì)數(shù)。每孔加入2 500個(gè)細(xì)胞，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，且每株細(xì)胞分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，避光加入20 μL（5 mg/mL）的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加入150 μL的DMSO，搖晃20 min后，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)其OD值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，胰酶消化后分組，再加入不同濃度藥物，貼壁生長(zhǎng)后用預(yù)冷PBS洗滌3次，并重懸。再按照試劑盒所示加入相應(yīng)試劑，上機(jī)前加入10 μL的PI，避光孵育10 min。加入400 μL的1×結(jié)合緩沖液，上機(jī)并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用PASW Statistics 18軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701細(xì)胞中相應(yīng)蛋白表達(dá)

提取分別轉(zhuǎn)染空載體pRcCMV、NS3、NS5A和Core表達(dá)質(zhì)粒的QSG7701細(xì)胞的總蛋白，檢測(cè)NS3、Core、NS5A蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了NS3、NS5A和Core表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞均有相應(yīng)蛋白的表達(dá)（圖1）。

圖1 NS3、Core、NS5A蛋白檢測(cè)Figure1 Detection of expressions of NS3, Core and NS5A proteins

2.2 L02、Core/QSG7701、NS3/QSG7701及 NS5A/QSG7701細(xì)胞中RASSF2 mRNA表達(dá)

提取L02、Core/QSG7701、NS3/QSG7701及NS5A/QSG7701細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)每株細(xì)胞RASSF2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，與L02細(xì)胞（RASSF2 mRNA表達(dá)量：0.582±0.066）比較，Core/QSG7701（RASSF2 mRNA表達(dá)量：0.027±0.004）、NS3/QSG7701（RASSF2 mRNA表達(dá)量：0.146±0.074）及NS5A/QSG7701（表達(dá)水平0.094±0.014）3株細(xì)胞的RASSF2 mRNA的表達(dá)均明顯降低（P=0.000、0.002、0.000）（圖2）。

圖2 RASSF2 mRNA表達(dá)檢測(cè)Figure 2 Detection of RASSF2 mRNA expressions

2.3 RASSF2A啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)

提取NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701細(xì)胞的DNA，進(jìn)行甲基化的修飾，檢測(cè)該3株細(xì)胞系的RASSF2A啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，顯示3株細(xì)胞RASSF2A啟動(dòng)子均發(fā)生了完全甲基化（圖3）。

圖3 MSP結(jié)果 M：甲基化特異性擴(kuò)增；U：非甲基化特異性擴(kuò)增Figure 3 Results of MSP M: Methylated-specific methylation;B: Unmethylated-specific methylation

2.4 5-aza-dC處理對(duì)各細(xì)胞RASSF2 mRNA表達(dá)的影響

每株細(xì)胞設(shè)置3組，分別為未加藥物的對(duì)照組、5 μmol/L 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組和10 μmol/L 5-azadC實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)4 d，檢測(cè)各組細(xì)胞RASSF2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果示：NS3/QSG7701細(xì)胞株中，與對(duì)照組比較，5 μmol/L 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組和10 μmol/L 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組RASSF2 mRNA的表達(dá)明顯增多（P=0.000、0.000）；Core/QSG7701細(xì)胞株中，與對(duì)照組比較，5 μmol/L 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組和10 μmol/L 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組RASSF2 mRNA的表達(dá)明顯增多（P=0.023、0.000）；NS5A/QSG7701細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，5 μmol/L 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組和10 μmol/L 5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組RASSF2 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化（P=0.170、0.270）（圖4）。

2.5 5-aza-dC處理對(duì)NS3/QSG7701和Core/QSG7701細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

將NS3/QSG7701和Core/QSG7701細(xì)胞分為未加藥物的對(duì)照組和10 μmol/L 5-aza-dC處理的實(shí)驗(yàn)組，NS3/QSG7701細(xì)胞株對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組凋亡率分別為（11.68±1.05）%、（27.60±1.57）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；Core/QSG7701細(xì)胞株對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組凋亡率分別為（20.38±1.62）%、（56.79±1.92）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（圖5）。同時(shí)，于10 μmol/L 5-aza-dC處理0、24、48、72 h后檢測(cè)細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組比較，NS3/QSG7701細(xì)胞72 h后，細(xì)胞的增殖明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）；Core/QSG7701細(xì)胞24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞的增殖均明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

圖4 5-aza-dC處理后各細(xì)胞RASSF2 mRNA的表達(dá) A：NS3/QSG7701細(xì)胞；B：Core/QSG7701細(xì)胞；C：NS5A/QSG7701細(xì)胞Figure 4 RASSF2 mRNA expressions in each type of cells after 5-aza-dC treatment A: NS3/QSG7701 cells; B: Core/QSG7701 cells;C: NS5A/QSG7701 cells

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡Figure 5 Cell apoptosis detected by flow cytometry

表1 5-aza-dC處理對(duì)NS3/QSG7701細(xì)胞增殖的影響（OD，±s）Table 1 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in NS3/QSG7701 cells (OD,±s)

表1 5-aza-dC處理對(duì)NS3/QSG7701細(xì)胞增殖的影響（OD，±s）Table 1 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in NS3/QSG7701 cells (OD,±s)

注：1)與0 h比較Note: 1) Comparison with 0-h value

時(shí)間 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 P1)0 h 0.09±0.008 0.09±0.008 —24 h 0.453±0.029 0.375±0.045 0.065 48 h 1.260±0.108 1.116±0.003 0.082 72 h 1.458±0.028 1.273±0.017 0.010

3 討 論

HCV基因組大約有9.6 kb，編碼約含3 000個(gè)氨基酸的多聚蛋白，能被病毒或宿主細(xì)胞的酶剪切成至少10種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在病毒的復(fù)制和致病過(guò)程中起著重要作用[16]。研究[17]表明，表達(dá)HCV相關(guān)蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至正常肝細(xì)胞后，能促進(jìn)肝細(xì)胞無(wú)限增殖，并導(dǎo)致其惡性轉(zhuǎn)化。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中最常見的現(xiàn)象，約60%的人類基因啟動(dòng)子區(qū)含有CpG島。CpG島甲基化使染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，高度螺旋化，凝縮成團(tuán)，失去轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制。目前發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子高甲基化的基因有Rb、P16INK4a、VHL、hMLH，這些啟動(dòng)子基因的高甲基化與細(xì)胞周期、凋亡、DNA的修復(fù)以及血管生成有關(guān)[18-21]。有研究[22-24]顯示抑癌基因RASSF2A基因失活最重要的機(jī)制是由于其啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化，在結(jié)腸癌的細(xì)胞系、結(jié)腸腺瘤以及結(jié)腸癌中常見RASSF2A啟動(dòng)子甲基化，而正常的結(jié)腸黏膜則否。

表2 5-aza-dC處理對(duì)Core/QSG7701細(xì)胞增殖的影響（OD，±s）Table 2 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in Core/QSG7701 cells (OD，±s)

表2 5-aza-dC處理對(duì)Core/QSG7701細(xì)胞增殖的影響（OD，±s）Table 2 Effect of 5-aza-dC treatment on proliferation in Core/QSG7701 cells (OD，±s)

注：1)與0 h比較Note: 1) Comparison with 0-h value

時(shí)間 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 P1)0 h 0.09±0.008 0.09±0.008 —24 h 0.394±0.005 0.354±0.012 0.006 48 h 1.150±0.017 0.999±0.028 0.001 72 h 1.417±0.058 1.136±0.029 0.002

既往研究[25]表明表觀遺傳學(xué)的變化是可逆的，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑可以改變DNA啟動(dòng)子甲基化的狀態(tài)，使其發(fā)生去甲基化，5-aza-dC是一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，當(dāng)DNA復(fù)制時(shí)，它可結(jié)合到5-甲基胞嘧啶的位置，使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶失活，達(dá)到去甲基化的作用，使甲基化的抑癌基因重新活化，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。5-aza-dC除了能夠誘導(dǎo)DNA去甲基化，還可以使組蛋白去甲基化，它還可還原甲基化或乙酰化所誘導(dǎo)的染色質(zhì)重塑[26]。在基因轉(zhuǎn)錄沉默過(guò)程中，組蛋白乙?；虳NA甲基化之間相互作用，啟動(dòng)子CpG島的甲基化使局部的組蛋白去乙酰化，組蛋白乙?；Ｗo(hù)DNA不發(fā)生甲基化[27]。

本研究檢測(cè)了正常肝細(xì)胞L02和NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701細(xì)胞系中RASSF2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常的肝細(xì)胞L02相比，NS3/QSG7701、Core/QSG7701及NS5A/QSG7701細(xì)胞的RASSF2 mRNA的表達(dá)均下降，表明NS3、Core和NS5A蛋白能抑制RASSF2 mRNA的表達(dá)；MSP檢測(cè)該3株細(xì)胞系中RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)RASSF2A基因啟動(dòng)子均發(fā)生了完全甲基化。為了進(jìn)一步分析RASSF2 mRNA的表達(dá)的下降是否與RASSF2A啟動(dòng)子的高甲基化有關(guān)，用不同濃度的去甲基化藥物5-aza-dC處理了NS3/QSG7701、Core/QSG7701、NS5A/QSG7701細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-aza-dC處理后，NS3/QSG7701和Core/QSG7701細(xì)胞RASSF2 mRNA的表達(dá)明顯升高，而NS5A/QSG7701細(xì)胞RASSF2 mRNA的表達(dá)沒(méi)有明顯改變。這說(shuō)明HCVNS3和Core可能通過(guò)RASSF2A啟動(dòng)子甲基化，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制作用，而NS5A/QSG7701細(xì)胞RASSF2 mRNA表達(dá)降低，可能除了啟動(dòng)子甲基化外，還有其他表觀遺傳學(xué)修飾參與了轉(zhuǎn)錄沉默。

細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡是反映細(xì)胞生物學(xué)行為的主要指標(biāo)之一，有研究[28-31]證實(shí)同為RASSF家族的RASSF5作為RAS效應(yīng)因子，連接RAS與HIPPO信號(hào)通路，在調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性和促進(jìn)衰老的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，抑癌基因RASSF2A很可能是通過(guò)與K-Ras相互作用發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的功能[32]，本研究結(jié)果顯示，10 μmol/L 5-aza-dC處理NS3/QSG7701和Core/QSG7701細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表明HCVNS3和Core可能是通過(guò)促進(jìn)RASSF2A啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，從而在HCV致癌過(guò)程中通過(guò)影響肝細(xì)胞的生物學(xué)行為參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生。

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