賈國叢，李陽，王堯河，常慶龍，陳雨婷 ，支慧娟

（1. 鄭州大學第三附屬醫(yī)院 乳腺二科，河南 鄭州 450052；2. 鄭州大學醫(yī)學科學院，河南 鄭州 450052）

乳腺癌是女性常見腫瘤之一[1-2]，約占女性全身腫瘤的7%～10%，是30～59歲中國女性發(fā)病率第一的惡性腫瘤[3]?；熓侨橄侔┑闹匾委熓侄沃唬窃S多患者在進行化療時出現(xiàn)了惡心、脫發(fā)、感覺異常、骨髓抑制等化療反應，這些副作用阻礙了臨床治療的進行[4]，也同時加大了患者對化療的恐懼心理。據(jù)文獻[5]報道，維生素C（VitC）對腫瘤化療藥具有增敏的效應，該效應可以減少紫杉醇（paclitaxel，PTX）的用量以及化療反應，同時可以提高化療藥物的療效，該效應在乳腺癌中鮮有報道。本研究采用的實驗材料是臨床上已經確診為乳腺癌的癌組織，進行體外培養(yǎng)[6]，來研究VitC對PTX的增敏效應，進一步探索臨床使用VitC對PTX提高療效降低毒副作用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤細胞 由鄭州大學第三附屬醫(yī)院乳腺二科提供乳腺癌標本。標本收集已征得患者本人及家屬同意，符合醫(yī)學倫理委員會要求。

1.1.2 主要試驗藥物及試劑 VitC購自上海現(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司；注射用紫杉醇購自上海創(chuàng)諾制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基、FBS、胰酶、MTS、PMS均購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Bax抗體和Bcl-2抗體均購自美國BD公司；免疫印跡試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 ELx808吸收光酶標儀購于美國伯騰儀器，MACSQuant流式細胞儀購于廣州譽維生物科技儀器有限公司，多色Western blot分析儀購于美國森西科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳腺癌細胞培養(yǎng) 取術中乳腺癌標本用加有雙抗的PBS組織洗液清洗8～10次，用2把手術刀交叉相切將組織切碎，將碎組織移至含有DMEM培養(yǎng)基的膠原蛋白酶III中，放入氣浴恒溫振蕩器中振蕩40～60 min，隨后將消化的碎組織塊倒入200目的濾網中過濾，將過濾液體放入50 mL離心管中，放入離心機，800 r/min離心8 min，棄上清液，加入PBS，反復吹打，1 200 r/min離心5 min，棄上清加入DMEM培養(yǎng)基移至細胞培養(yǎng)瓶。倒置顯微鏡下觀察，用反復貼壁法和低濃度消化法去除成纖維細胞和肌細胞，得到腫瘤細胞。細胞置于5%O2、5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗 將處于對數(shù)期的細胞以每孔約5 000個細胞鋪于96孔板中，每孔100 μL，每組設置6個復孔，設置空白組和對照組。放入細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后加藥。加藥方式如下：⑴ 不同濃度VitC單獨24 h；⑵ 不同濃度PTX單獨24 h；⑶ 不同濃度的VitC與一定濃度的PTX聯(lián)合24 h。兩種藥物單藥使用時設置9個等比的濃度梯度，VitC濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 23、0.078 1、0.039 0、0.019 5 mmol/L，PTX 濃 度 為 19、9.5、4.75、2.375、1.187、0.593、0.296、0.148、0.074 nmol/L， 聯(lián)合時 PTX濃度為 19、9.5、4.75、2.375、1.187、0.593、0.296、0.148、0.074 nmol/L，VitC濃 度為1 mmol/L。IncuCyte Zoom?設置每2 h拍照1次，72 h后將96孔板取出后每孔加入MTS和PMS（20:1）混合液20 μL。培養(yǎng)箱靜置3 h后，酶標儀測定490 nm處每孔的OD值（A490nm）。分別計算出VitC、PTX的IC50。實驗重復3次，取3次的平均值為實驗結果。腫瘤細胞增殖抑制率=（細胞對照組OD值A490nm-實驗對照組OD值A490nm）/（細胞對照組OD值A490nm-空白對照組OD值A490nm）×100%。按照金氏修正公式計算q值，公式為q=E（A+B）/（EA+EB-EA×EB）。E（A+B）為兩種藥物聯(lián)合使用的效應，EA為A藥單用的效應EB為B藥單用的效應。分子為實測合并效應，分母為預測合并效應。如果q值為0.85～1.15之間則表明藥效單純疊加，1.15～20說明藥物之間有協(xié)同效應，＜1.15說明藥物之間有拮抗作用。

1.2.3 細胞凋亡實驗 取對數(shù)期增長的細胞，細胞計數(shù)后以每孔1×105細胞鋪于12孔板中，待置于5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中24 h后分為對照組，高、中、低濃度（2、1、0.5 mmol/L）VitC組，PTX（4 nmol/L）組，PTX（4 nmol/L）聯(lián)合VitC（2、1、0.5 mmol/L）組，每組3個復孔。待同步細胞周期加藥48 h，用不含EDTA的胰酶消化后，1 200 r/min離心5 min收集細胞。按照試劑盒說明書步驟依次加入FITC和PI混勻后避光室溫下反應10 min后進行流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.2.4 Western blot檢測增殖和凋亡相關蛋白 乳腺癌原代細胞培養(yǎng)24 h后等待同步細胞周期，按照實驗設計加藥：對照組，PTX（4 nmol/L）組，PTX（4 nmol/L）聯(lián)合VitC（2、1、0.5 mmol/L）組，每組設3個復孔。按照試劑盒說明書提取總蛋白，加入裂解液，12 000 r/min、4 ℃、離心5 min，移取上清液。10%SDS-PAGE凝膠電泳（80 V 25～35 min后調整至120 V電泳1～1.5 h），將蛋白質電轉移至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS沖洗3次。將抗體caspase-3和Bcl-2抗體稀釋至0.1 μg/mL后加到NC膜正面，4 ℃冰箱過夜。之后加入1:4 000稀釋的紅色熒光標記的羊抗兔IgG，室溫反應2 h，PBS沖洗3次。以β-actin為內參，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描結果并使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參灰度比值來表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

圖1 乳腺癌細胞原代培養(yǎng)（×40） A：培養(yǎng)48 h；B：培養(yǎng)3 d；C：培養(yǎng)5 d；D：培養(yǎng)7 dFigure1 Primary culture of breast cancer cells (×40) A: Cultured for 48 h; B: Cultured for 72 h; C: Cultured for 3 d; D: Cultured for 7 d

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 細胞培養(yǎng)結果

48 h后觀察細胞，細胞貼壁生長，并見有成纖維細胞和肌細胞生長。待72 h后采用差速貼壁法去除成纖維細胞和肌細胞。等細胞長滿后傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)3～7 d傳至3代以后。乳腺癌細胞形態(tài)不規(guī)則，鏡下觀察細胞形態(tài)不一，成纖維細胞呈長梭形易于區(qū)分（圖1）。

2.2 VitC和PTX單藥及聯(lián)合對乳腺癌細胞增殖抑制作用

由實驗結果得出，PTX單獨用藥對乳腺癌細胞的增殖抑制呈藥物濃度依賴性，IC50=8.6 nmol/L；VitC單獨用藥藥物濃度＞1.25 mmol/L時對乳腺癌細胞的增殖抑制呈濃度相關性，濃度＜1.25 mmol/L抑制率大幅度降低且無濃度相關性，IC50=2.5 mmol/L；VitC和PTX聯(lián)合用藥對乳腺癌細胞增殖抑制呈藥物濃度依賴性（圖2），IC50=2.8 nmol/L。VitC聯(lián)合PTX組的增值抑制率均大于同濃度單用PTX組。VitC濃度為1 mmol/L時的有效抑制率為3%，PTX單用藥濃度分別為0.004 75 μmol/L、0.002 3 μmol/L、0.001 18 μmol/L時的有效抑制率為55%、45%、29%，VitC濃度為1 mmol/L分別與濃度為0.004 75、0.002 37、0.001 18 μmol/L的PTX聯(lián)合用藥時的增值抑制率為82%、67%、50%，按金氏公式計算q值分別為1.37、1.36、1.52。以上濃度依賴聯(lián)合實驗q值均＞1.15，實驗結果提示VitC對PTX有增敏效應。

圖2 PTX和VitC單藥及聯(lián)合對乳腺癌細胞生長的抑制作用 A：不同濃度的VitC單藥；B：不同濃度的PTX單藥；C：不同濃度的PTX聯(lián)合1 mmol/L VitCFigure 2 Inhibitory effects of PTX and VitC alone and combination on growth of breast cancer cells A: Different concentrations of VitC; B: Different concentrations of PTX; C: Different concentrations of PTX plus 1 mmol/L VitC

2.3 VitC聯(lián)合PTX對乳腺癌細胞凋亡的影響

VitC低濃度（0.5 mmol/L）組與對照組相比較，凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但中（1 mmol/L）、高濃度（2 mmol/L）組凋亡率高于對照組（均P＜0.05）。PTX組和VitC聯(lián)合PTX組與對照組相比較，凋亡率均明顯升高，且VitC聯(lián)合PTX組凋亡率明顯高于PTX組（均P＜0.05）（表1）（圖3）。

2.4 檢測增殖和凋亡相關蛋白

PTX單藥及聯(lián)合不同濃度VitC作用后乳腺癌細胞caspase-3和Bcl-2蛋白的表達。乳腺癌細胞經PTX單藥及與不同濃度的VitC聯(lián)合作用，隨著VitC濃度的增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達逐漸降低，凋亡促進蛋白caspase-3的表達逐漸升高。PTX單藥、PTX+0.5 mmol/L VitC組、PTX+VitC 1 mmol/L組、PTX+VitC 2 mmol/L組與空白對照組比較蛋白相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖4）。

表1 各組乳腺癌細胞的凋亡率（±s）Table 1 The apoptosis rates of each group of breast cancer cells(±s)

表1 各組乳腺癌細胞的凋亡率（±s）Table 1 The apoptosis rates of each group of breast cancer cells(±s)

組別 凋亡率（%）對照組 10.9±2.9 2 mmol/L VitC組 55.6±4.91)1 mmol/L VitC組 30.5±5.01)0.5 mmol/L VitC組 12.3±3.6 PTX組 22.6±3.51)PTX+2 mmol/L VitC組 79.1±5.61),2)PTX+1 mmol/L VitC組 61.1±4.91),2)PTX+0.5 mmol/L VitC組 34.9±4.71),2)F 89.8 P 0.00

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 A：對照組；B：2 mmol/L VitC組；C：1 mmol/L VitC組；D：0.5 mmol/L VitC組；E：PTX組；F：PTX+2 mmol/L VitC組；G：PTX+1 mmol/L VitC組；H：PTX+0.5 mmol/L VitCFigure 3 Apoptosis detection by flow cytometry A: Control group; B: 2 mmol/L VitC group; C: 1 mmol/L VitC group; D: 0.5 mmol/L VitC group; E: PTX group; F: PTX+2 mmol/L VitC group; G: PTX+1 mmol/L VitC group; H: PTX+0.5 mmol/L VitC group

圖4 caspase-3和Bcl-2蛋白表達檢測 1：對照組；2：PTX單藥；3：PTX+0.5 mmol/L VitC組；4：PTX+1 mmol/L VitC組；5：PTX+2 mmol/L VitC組1）與對照組比較，P＜0.05Figure 4 Determination of caspase-3 and Bcl-2 protein expressions 1: Control group; 2: PTX alone group;3: PTX+0.5 mmol/L VitC group; 4: PTX+1 mmol/L VitC; 5: PTX+2 mmol/L VitC 1) P＜0.05 vs. control group

3 討 論

PTX作為臨床常用化療藥，用于治療肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細胞癌以及其他的實體腫瘤[7]。但是，PTX化療的副作用會隨著劑量的增加而增加[8]。有文獻[9]報道，VitC在與順鉑聯(lián)合治療結腸癌時可以顯著降低順鉑的毒副作用。在臨床當中我們需要找尋一種既能不降低化療效果又能減少PTX副作用的方法。

VitC在腫瘤治療當中一直作為輔助藥物，所以使用劑量都較低[10]。低劑量的VitC（25～50 μg/mL）并不能誘導凋亡，與此相反，它與干細胞的增殖和維持有關[11-12]。后來，人們發(fā)現(xiàn)口服和靜脈注射VitC具有不同的藥代動力學[13]。早在1979年就有相關文獻[14]報道，大劑量（10 g/d）在治療腫瘤方面是有效的。近期國外有研究[15]報道，VitC聯(lián)合其他抗腫瘤藥物能對腫瘤細胞產生抑制作用。也有相關報道[16]，大劑量VitC在動物模型中也具有明顯的抗腫瘤作用。鑒于這些研究結果，越來越多的I、II期臨床試驗評估靜脈注射VitC治療癌癥的可行性[17-20]。在本研究中，體外實驗得到大劑量VitC可明顯誘導乳腺癌腫瘤細胞凋亡的結論。而且，VitC濃度＜1.25 mmol/L之后抑制腫瘤增值效應顯著下降。這些發(fā)現(xiàn)為進一步研究VitC增敏PTX來提高對乳腺癌細胞殺傷作用和降低毒副作用提供了依據(jù)。

VitC治療腫瘤的確切機制還不是很清楚。目前提出了幾種假說。VitC抑制了透明質酸酶的活性，防止了膠原蛋白的水解[21]，從而加強了膠原蛋白的結構抑制了腫瘤細胞的轉移。VitC是驅動雙氧加酶反應的輔助因子，包括組蛋白去甲基化酶，缺氧誘導因子脯氨酰羥化酶和膠原脯氨酰羥化酶[22]。由Creagan等[23-24]在美國梅奧診所所做的臨床試驗表明口服相同劑量的VitC治療腫瘤是無效的。VitC通過靜脈而不是口服的方法在外周血中達到毫摩爾級別的濃度可以殺死腫瘤細胞而不傷害正常細胞。VitC在腫瘤細胞周圍能介導促氧化作用產生過氧化氫（H2O2）從而殺死腫瘤細胞。有文獻[25]報道VitC作為一種促氧化劑，可以激活ATM/AMTK信號傳導通路，導致卵巢癌細胞中的雷帕霉素蛋白受到抑制并促進了卵巢癌細胞的死亡。

本研究顯示，VitC和PTX單獨用藥時對乳腺癌細胞有增殖抑制和誘導凋亡的作用，作用呈濃度依賴性。通過流式細胞儀測得結果顯示，聯(lián)合用藥后PTX的促凋亡作用明顯增強，均大于單用PTX時的促凋亡作用。Western blot檢測VitC對PTX的增敏作用，結果凋亡蛋白caspase-3的表達較PTX單用明顯增多，凋亡抑制蛋白Bcl-2明顯減少。Ma等[25]有相關研究表明，VitC可以引起SHIN3人卵巢癌細胞的DNA嚴重損傷，但是加入過氧化氫酶后這種作用可以被逆轉。VitC高劑量靜脈注射似乎意外的安全并沒有較為嚴重副作用[26]。國內外也有許多學者在研究VitC聯(lián)合其他的化療藥物治療腫瘤的相關研究，結果基本一致，VitC聯(lián)合化療藥物可以減少化療藥物的用量并提高藥物的療效，這些結果是令人鼓舞的。綜上所述，VitC聯(lián)合PTX可以成為治療乳腺癌低毒高效的藥物組合。

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