蘇文杰
(通渭縣雞川鎮(zhèn)政府,甘肅 定西 743300)
花粉管通道法轉(zhuǎn)Bar基因胡麻后代的分子檢測(cè)
蘇文杰
(通渭縣雞川鎮(zhèn)政府,甘肅 定西 743300)
以花粉管通道法轉(zhuǎn)Bar基因胡麻T(mén)1代胡麻為研究對(duì)象,用CTAB法提取DNA,經(jīng)PCR分別擴(kuò)增外源基因Bar基因的片段,擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析,篩選Bar基因成功整合到基因組的單株,結(jié)果在114個(gè)T1系亞麻植株中檢測(cè)出5株含有Bar基因的陽(yáng)性亞麻植株,轉(zhuǎn)化率為4.4%。探討了花粉管通道法轉(zhuǎn)Bar基因在亞麻中的應(yīng)用前景。
花粉管通道法;轉(zhuǎn)基因;胡麻;PCR檢測(cè)
油用亞麻,又名胡麻,拉丁學(xué)名Linum usitatissimum,屬于亞麻科亞麻屬普通亞麻的一個(gè)變種,是一年生或多年生草本植物。油用亞麻是我國(guó)五大油料作物之一,主要分布在甘肅、內(nèi)蒙古、山西、寧夏、河北、新疆及青海等省區(qū)。
利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種可以打破物種間的遺傳障礙,實(shí)現(xiàn)優(yōu)良目的基因的定向轉(zhuǎn)移,同時(shí)具有后代易于穩(wěn)定、育種周期短等優(yōu)點(diǎn),為作物育種和品質(zhì)改良提供了新的途徑。已報(bào)道亞麻遺傳轉(zhuǎn)化主要采用基因槍導(dǎo)入法和農(nóng)桿菌侵染法,但這兩種方法都需要經(jīng)歷組織培養(yǎng)的過(guò)程,具有實(shí)驗(yàn)設(shè)備配備要求高、操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)?;ǚ酃芡ǖ婪ㄊ抢弥参锸诜酆笮纬傻奶烊换ǚ弁ǖ?,經(jīng)珠心通道,將外源DNA攜入胚囊,從而轉(zhuǎn)化早期胚胎細(xì)胞的方法。它避免了繁瑣的組織培養(yǎng)過(guò)程,操作簡(jiǎn)單、成本低廉,可直接用于常規(guī)育種。自花粉管通道法問(wèn)世以來(lái),已在水稻等多種植物的遺傳轉(zhuǎn)化中取得成功,但應(yīng)用在油用亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化尚未見(jiàn)報(bào)道[1]。
Bar基因能使植物抵抗如草丁膦等以PPT為活性成分的除草劑,具有PPT活性的除草劑具有輸導(dǎo)型滅生性,殺草譜廣,對(duì)植物的地上部分和地下部分均有枯殺作用,而且在土壤中易被代謝分解,殘留期短,半衰期只有2~3 d。目前,Bar基因已導(dǎo)入水稻、玉米、小麥、大麥、煙草、馬鈴薯、番茄、高粱、燕麥、甘蔗、番術(shù)瓜、菜豆、豌豆、棉花等作物[2]。本論文以花粉管通道法導(dǎo)入Bar基因的T1代胡麻材料為研究對(duì)象,通過(guò)PCR分子檢測(cè)手段篩選Bar基因成功整合到基因組的單株,并統(tǒng)計(jì)分析轉(zhuǎn)化效率,為開(kāi)展胡麻轉(zhuǎn)基因育種后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
2.1 材料
2.1.1 植物材料
試驗(yàn)用花粉管通道法轉(zhuǎn)Bar基因胡麻T(mén)0代由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所胡麻課題組提供,播種后分單株取樣檢測(cè)。
2.1.2 主要試劑
PremixTaq DNA聚合酶、dNTP、DNAMarker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,PCR引物由Invitrogen公司合成。
2.1.3 主要儀器
臺(tái)式冷凍離心機(jī)、基因擴(kuò)增儀、凝膠成像儀、電泳儀及移液槍。
2.1.4 主要緩沖液配方
CTAB提取緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0),20 mmol/L EDTA (pH值8.0),1.5 mol/L NaCl,2% CTAB(W/V),4%PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V),PVP和巰基乙醇使用前加入[3]。TE:10mmol/LTris-HCl(pH值8.0),1mmol/LEDTA。6瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液:0.25%溴酚藍(lán)(W/V),40%蔗糖(W/V)。1TAE電泳緩沖液:40 mmol/LTris-乙酸,1 mmol/LEDTA。
2.2 方法
2.2.1CTAB法提取DNA
取樣:摘取T1代114株胡麻的幼嫩組織,然后分管冷藏。
2.2.2PCR擴(kuò)增
以含有由CaMV35S啟動(dòng)子、Bar基因和NOS終止子組成的表達(dá)框的質(zhì)粒pG4A作為PCR檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照,未進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作的胡麻植株為陰性對(duì)照,水做空白對(duì)照,用Bar基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體系如下:
PCR循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,72℃后延伸5 min,經(jīng)32個(gè)循環(huán)后10℃保存。
2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
1.5%瓊脂糖電泳點(diǎn)樣總量為6 μL體系,加樣順序?yàn)? μL溴酚蘭+5 μL擴(kuò)增樣品。
3.1 結(jié)果
3.1.1PCR陽(yáng)性植株的鑒定
為了驗(yàn)證Bar基因的導(dǎo)入與否,將T1代114株胡麻的幼嫩組織摘取分管冷藏,以陽(yáng)性植株為對(duì)照進(jìn)行PCR分析。從中提取DNA進(jìn)行Bar基因的擴(kuò)增,其結(jié)果如圖1所示。
1005-2690(2017)03-0117-02
S512.1
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