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        培元解郁方對慢性應(yīng)激BALB/c小鼠的抗抑郁作用及TRY-KYN代謝途徑的調(diào)節(jié)

        2017-03-29 01:45:12李海娜李麗娜范盎然王萍萍劉保秀暢洪昇
        世界中醫(yī)藥 2017年1期
        關(guān)鍵詞:天絲培元喹啉

        李海娜 張 靜 李麗娜 范盎然 于 雪 王萍萍 劉保秀 暢洪昇

        (1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京,100102; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京,100029)

        培元解郁方對慢性應(yīng)激BALB/c小鼠的抗抑郁作用及TRY-KYN代謝途徑的調(diào)節(jié)

        李海娜1張 靜1李麗娜2范盎然2于 雪2王萍萍1劉保秀1暢洪昇1

        (1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京,100102; 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京,100029)

        目的:研究四逆散、天絲飲、培元解郁方的抗抑郁作用及其對血清皮質(zhì)酮含量和色氨酸(TRP)-犬尿氨酸(KYN)途徑關(guān)鍵代謝酶色氨酸2,3-雙加氧酶(TDO)的影響。方法:使用束縛加噪聲造成小鼠抑郁模型,采用Noldus EthoVision XT9系統(tǒng)采集分析小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間,采用HPLC-MS/MS技術(shù)檢測血清色氨酸(TRP)、犬尿氨酸(KYN)、犬尿烯酸(KA)、喹啉酸(Q)、皮質(zhì)酮(C)含量,實時熒光定量PCR檢測肝組織中TDO的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:束縛加噪聲應(yīng)激5 d后可以引起模型組小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間延長,血清皮質(zhì)酮含量增高,KYN/TRP、KYN/KA比值升高,KYN/Q比值降低。四逆散、天絲飲、培元解郁方能縮短小鼠不動時間(P<0.01),降低血清皮質(zhì)酮含量(P<0.05),提高KYN/TRP、KYN/Q比值(P<0.05),降低KYN/KA比值。結(jié)論:四逆散、天絲飲、培元解郁方具有抗抑郁藥物樣作用,這一作用與對抗應(yīng)激引發(fā)的血清皮質(zhì)酮升高,抑制色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑中的神經(jīng)毒性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生并提高神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。

        四逆散;天絲飲;培元解郁方;抗抑郁;色氨酸-犬尿氨酸

        本實驗將四逆散、天絲飲進(jìn)行合方,組成培元解郁方,采用慢性應(yīng)激BALB/C小鼠抑郁模型,對3個處方的抗抑郁作用進(jìn)行了觀察,并就其對色氨酸(Tryptophan,TRY)-犬尿氨酸(Kynurenine,KYN)代謝途徑及其關(guān)鍵酶TDO含量的影響進(jìn)行了研究,以明確三者的抗抑郁效應(yīng)和機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 雄性BALB/C小鼠,體重(22±3)g,60只,購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。許可證號:SCXK(京)2011-0004。

        1.2 藥品和試劑 培元解郁配方顆粒由制巴戟天(批號:15001781)、北柴胡(批號:13002303)、鹽菟絲子(批號:15004252)、白芍(批號:13002773)、炙甘草(批號:13002752)、麩炒枳實(批號:120601)組成。天絲飲配方顆粒由制巴戟天、鹽菟絲子組成。四逆散配方顆粒由北柴胡、白芍、炙甘草、枳實組成。上述藥材飲片顆粒均由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。鹽酸丙咪嗪片(批號:20140302A),上海信誼九福藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

        皮質(zhì)酮(Corticosterone,貨號C0388,TCI),DL-犬尿氨酸(貨號61250,Sigma),犬尿喹啉酸(貨號K3375,Sigma),喹啉酸(貨號A11414,Alfa Aesar),色氨酸(貨號T103480,Aladdin),5HT(貨號111656-200401,中檢所),甲醇、已腈等均購自Fisher公司。Trizol(貨號:15596026,Invitrogen),HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號CW0744),UItraSYBR Mixture(貨號CW0957),均購自Cwbio公司。氯仿、異丙醇、乙醇均為分析純。

        1.3 實驗儀器 HPLC-MS/MS(美國戴安Ultimate3000-ABI公司3200 Q TRAP),Noldus EthoVision XT9(荷蘭Noldus公司),熒光定量PCR儀(美國CFX96)。

        1.4 分組和給藥 將BALB/C小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組、四逆散組、天絲飲組、培元解郁方組,每組10只。除空白組外,其余小鼠每天上午8點至10點、下午16點至18點進(jìn)行束縛加噪聲刺激(25Hz)。連續(xù)應(yīng)激5 d,應(yīng)激同時灌胃給藥。小鼠給藥劑量按臨床等效劑量換算,丙咪嗪給藥劑量為50 mg/kg,天絲飲配方顆粒給藥劑量為1.5 g/kg,四逆散配方顆粒給藥劑量為0.8 g/kg,培元解郁配方顆粒給藥劑量為4.6 g/kg。各組小鼠分別于末次應(yīng)激后進(jìn)行行為學(xué)檢測,行為檢測結(jié)束之后取材,并對所取樣品進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

        1.5 強(qiáng)迫游泳實驗 將小鼠置于水深10 cm的玻璃缸中,玻璃缸高25 cm,直徑10 cm,水溫保持在25 ℃,觀察6 min內(nèi)小鼠的游泳情況,并記錄后4 min的累計不動時間,數(shù)據(jù)由Noldus EthoVision XT9采集分析。

        1.6 血清色氨酸(TRP)、犬尿氨酸(KYN)、犬尿烯酸(KA)、喹啉酸(Q)、皮質(zhì)酮(C)含量測定 行為學(xué)測試結(jié)束后取材。小鼠摘眼球取血,血液于4 ℃冰箱靜置,凝血后離心,轉(zhuǎn)速2 500 r/min、溫度4 ℃,時間15 min,離心后吸取上清并置-20 ℃冷凍保存。待血清樣本融化后(和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品)蝸旋1 min后取200 μL,高速13 200 r/min,冷凍離心5 min,取上清液用HPLC-MS/MS檢測犬尿氨酸(KYN)、色氨酸(TRP)、犬尿烯酸(KA)、喹啉酸(Q)、皮質(zhì)酮(C)含量,以犬尿氨酸/色氨酸比值表示TDO活性,犬尿氨酸/犬尿烯酸反映神經(jīng)保護(hù)作用,犬尿氨酸/喹啉酸比值反映神經(jīng)毒性作用。

        1.7 液相條件 色譜柱SLab HP-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃,流速0.8 mL/min,流動相A為水,流動相B為乙腈,進(jìn)樣量為20 μL。梯度洗脫:0~1 min,流動相B體積分?jǐn)?shù)為95%;1~8 min,流動相B體積分?jǐn)?shù)為95%~40%;8~8.1 min,流動相B體積分?jǐn)?shù)為40%~0%;8.1~10 min,流動相B體積分?jǐn)?shù)為0%;10~10.1 min,流動相B體積分?jǐn)?shù)為0%~95%;10.1~15 min,流動相B體積分?jǐn)?shù)為95%。

        1.8 質(zhì)譜條件 離子源為+ESI電噴霧離子源,正離子方式;掃描方式采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測;氣簾氣:20psi;碰撞氣:Medium;噴霧電壓:+5 500 V;霧化溫度:500 ℃;霧化氣:55 psi;輔助氣:60 psi;射入電壓:10;碰撞室射出電壓:2.0。

        1.9 肝TDO含量檢測 將肝臟置于液氮內(nèi)速凍,采用一步法抽提肝臟總RNA,吸取1 μL肝臟總RNA溶液,用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用UItraSYBR Mixture進(jìn)行擴(kuò)增,采用熒光定量PCR方法檢測含量,具體實驗操作參考產(chǎn)品說明書。用2-△△ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。目的基因引物:TDO F序列為AAGGATTCAGGCTAAAACCGACT,TDO R序列為TGCACGGTATGACAGTCGTC,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為146bp。

        表1 對小鼠強(qiáng)迫游泳行為的影響

        注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

        2 結(jié)果

        2.1 強(qiáng)迫游泳 慢性束縛加噪聲刺激能夠延長模型組小鼠的強(qiáng)迫游泳不動時間。而與模型組相比較,鹽酸丙咪嗪、四逆散、天絲飲、培元解郁方組小鼠游泳不動時間顯著縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

        2.2 血清TRY-KYN代謝產(chǎn)物及皮質(zhì)酮含量 與模型組相比,丙咪嗪、四逆散、天絲飲、培元解郁方組血清皮質(zhì)酮含量降低。空白組、丙咪嗪、四逆散、天絲飲、培元解郁方組KYN/TRP比值增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),四逆散、天絲飲、培元解郁方組KYN/Q比值增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),培元解郁方組KYN/KA比值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2、表3。

        表2 對血清皮質(zhì)酮含量的影響

        注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

        表3 對慢性應(yīng)激BALB/C小鼠TRY-KYN代謝途徑的影響

        注:與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

        2.3 肝臟TDOmRNA表達(dá)的影響 與空白組比較,慢性應(yīng)激組TDO mRNA表達(dá)有所提高,但差異不明顯;與慢性應(yīng)激組比較四逆散、天絲飲、培元解郁方組TDO mRNA也有所提高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

        表4 對TDOmRNA表達(dá)的影響

        3 討論

        本實驗所研究的3個中藥復(fù)方分別是四逆散、天絲飲和培元解郁方,其中培元解郁方來自于四逆散和天絲飲的合方。四逆散出自《傷寒論》,是經(jīng)典的疏肝解郁的祖方[1]。近年來研究表明:四逆散在多種動物抑郁模型中起到抗抑郁作用,其抗抑郁機(jī)制與影響5-HT能神經(jīng)元,促進(jìn)海馬神經(jīng)元發(fā)生和神經(jīng)營養(yǎng)[2],保護(hù)額葉和海馬神經(jīng)元線粒體的損傷[3],緩解應(yīng)激后高度活躍的下丘腦-皮質(zhì)-腎上腺軸等有關(guān)[4]。天絲飲出自《辨證錄》,具有補(bǔ)腎元、定神志的功效,是治療健忘、驚悸、恐懼等情志病的基本方。天絲飲由菟絲子和巴戟天組成,研究表明,巴戟天中的巴戟天寡糖和菟絲子中的金絲桃苷均具有較好的抗抑郁作用。中醫(yī)對抑郁癥有虛郁相關(guān)的發(fā)病和治療思想,并由此形成了培元解郁的治法[5],本實驗以這一理論為基礎(chǔ)來研究四逆散與天絲飲合方抗抑郁作用及其對TRY-KYN代謝途徑的影響。

        實驗動物采用BALB/c小鼠。BALB/c小鼠是一個常用的近交系小鼠品系,具有較低的社會性,利用BALB/c小鼠能較好的復(fù)制人類的一些心身疾病模型[6-7]。本實驗用BALB/c小鼠成功的復(fù)制了抑郁癥模型,模型組動物強(qiáng)迫游泳不動時間延長,表現(xiàn)出“行為絕望”的抑郁狀態(tài)。

        應(yīng)激指當(dāng)機(jī)體受到各種有害刺激,如缺氧、創(chuàng)傷、手術(shù)、饑餓、疼痛、寒冷等時做出相應(yīng)的應(yīng)答狀態(tài),包括神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌等多方面的綜合反應(yīng),研究表明應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體HPA軸興奮性提高,血中ACTH濃度立即增加,糖皮質(zhì)類固醇(GC)分泌也相應(yīng)增加,從而動員儲能,使血糖升高,心血管張力提高,而與此同時免疫功能被抑制。目前常用的應(yīng)激抑郁模型有慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激、慢性束縛應(yīng)激、行為絕望、獲得性無助、糖皮質(zhì)激素等。其中慢性束縛應(yīng)激指長時間剝奪身體的自由活動,束縛制動刺激作為應(yīng)激源的應(yīng)激動物模型,是一種慢性的非耗竭性應(yīng)激[8]。研究表明慢性束縛應(yīng)激可引起動物“行為絕望狀態(tài)”,即強(qiáng)迫游泳實驗或懸尾實驗不動時間延長,如采用慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)BALB/c小鼠抑郁模型,行為學(xué)測試顯示模型小鼠懸尾不動時間明顯延長(P<0.01)[9]。本實驗在慢性束縛的基礎(chǔ)上又增加了噪聲刺激來誘導(dǎo)抑郁模型,以加強(qiáng)誘導(dǎo)抑郁模型的效果,縮短造模時間。強(qiáng)迫游泳實驗結(jié)果顯示慢性應(yīng)激可以引起模型組小鼠強(qiáng)迫游泳不動時間延長,而四逆散、天絲飲、培元解郁方三個中藥復(fù)方均能縮短小鼠游泳不動時間,作用效果與丙咪嗪相似,抗抑郁作用較強(qiáng)。

        抑郁癥的發(fā)病涉及到神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫多種系統(tǒng)的失衡[10],目前存在多種假說,其中較為公認(rèn)的有細(xì)胞因子假說,下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸假說,單胺能假說,神經(jīng)可塑性假說等。近年來,色氨酸—犬尿氨酸(TRY-KYN)代謝異常逐漸受到重視。色氨酸是神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的合成原料,能夠在色氨酸羥化酶作用下合成5-HT,而在IDO或TDO的作用下,則發(fā)生TRY-KYN代謝形成犬尿氨酸等活性產(chǎn)物。當(dāng)TRP-KYN代謝發(fā)生異常,5-HT的合成原料色氨酸耗竭,造成5-HT合成降低進(jìn)而引發(fā)5-HT能神經(jīng)元功能障礙;而與此同時TRP-KYN代謝產(chǎn)生的犬尿氨酸進(jìn)一步生成神經(jīng)元活性代謝產(chǎn)物喹啉酸,喹啉酸的增加使NMDA過度激活和自由基的產(chǎn)生,進(jìn)而引發(fā)中樞特定部位神經(jīng)元變性[11-12]。TDO主要存在于肝臟內(nèi),是肝臟內(nèi)色氨酸的主要降解酶。TDO活性的增強(qiáng),可促進(jìn)TRP-KYN代謝,而研究表明應(yīng)激狀態(tài)下的HPA軸興奮性提高,腎上腺分泌應(yīng)激激素糖皮質(zhì)類固醇(GC)升高,而持續(xù)高水平的糖皮質(zhì)激素不僅能導(dǎo)致海馬損傷而引起抑郁癥;還能增加色氨酸-犬尿氨酸通路的降解酶TDO的表達(dá)和活性[13],進(jìn)而促進(jìn)TRP-KYN代謝,導(dǎo)致色氨酸耗竭,造成5-HT合成降低,研究表明5-HT不足可使杏仁核抑制作用減弱,繼而皮質(zhì)醇產(chǎn)生增多,大腦皮質(zhì)興奮,出現(xiàn)情緒不穩(wěn)或煩躁失眠等抑郁癥狀[14]。另外犬尿氨酸神經(jīng)元活性代謝產(chǎn)物的增加,是TRP-KYN代謝異常引發(fā)抑郁癥的又一原因,犬尿氨酸有2種代謝途徑,一是在犬尿氨酸羥化酶的作用下生成3-羥基犬尿氨酸繼而在多種酶的催化下生成喹啉酸(Q)。另外一條通路是在犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成犬尿烯酸(KA)。喹啉酸是NMDA受體的內(nèi)源性激動劑,具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性,其水平升高可能導(dǎo)致軸突的神經(jīng)退行性疾病[15],3-羥基犬尿氨酸則引起神經(jīng)元的凋亡。而犬尿烯酸是NMDA受體的內(nèi)源性拮抗劑,能夠?qū)灌岙a(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用,具有神經(jīng)保護(hù)作用[16-17]。有研究表明通過腦室外注射犬尿烯酸可緩解促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素誘發(fā)的隔離應(yīng)激雛雞的異常行為(如覺醒時間延長和鳴叫次數(shù)增多)[18]。

        在本實驗中,應(yīng)激組血清皮質(zhì)酮含量與對照組相比升高,而丙咪嗪、四逆散、天絲飲、培元解郁方組血清皮質(zhì)酮含量顯著降低,表明四逆散、天絲飲、培元解郁方組能夠?qū)蛊べ|(zhì)酮,從而減輕其對海馬組織的損傷而發(fā)揮抗抑郁作用。但是,丙咪嗪、四逆散、天絲飲、培元解郁方并不能通過降低血清皮質(zhì)酮含量引起TDO活性及表達(dá)的降低,相反,本研究中,TDO活性反而明顯增強(qiáng)。其原因可能是,TDO活性還受胰高血糖素、高濃度輔酶(如NADPH)、甲基吡啶羧酸羧化酶(PAC)、3-羥-2-氨基苯甲酸加氧酶(3-HAAO)、活性雌激素、血紅蛋白等含量的影響。在本實驗的研究中,上述因素可能通過調(diào)節(jié)TDO的活性而參與到TRP-KYN的代謝中來,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另一方面,四逆散、天絲飲、培元解郁方可以升高KYN/Q比值,其中培元解郁方尚可以降低KYN/KA比值,表明3組方均可以使色氨酸-犬尿氨酸通路具有神經(jīng)毒性的代謝產(chǎn)物喹啉酸減少,而培元解郁方同時能增加具有神經(jīng)保護(hù)作用的代謝產(chǎn)物犬尿烯酸。提示3組方可以促進(jìn)犬尿氨酸向有利機(jī)體的方向代謝,間接的調(diào)節(jié)NMDA受體活性,進(jìn)而抑制神經(jīng)毒性,提高神經(jīng)保護(hù)作用。

        綜上,四逆散、天絲飲、培元解郁方3組方具有一定的抗抑郁作用,該作用與對抗皮質(zhì)酮,同時促進(jìn)TRP-KYN以有利于機(jī)體的方式代謝,間接的調(diào)節(jié)NMDA受體活性,抑制TRP-KYN通路神經(jīng)毒性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生,提高神經(jīng)保護(hù)作用等有關(guān)。其中,四逆散、天絲飲合方組成的培元解郁方在抗抑郁作用及調(diào)節(jié)TRP-KYN代謝產(chǎn)物方面有更好的效應(yīng)。

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        (2016-02-22收稿 責(zé)任編輯:張文婷)

        Antidepressant Effects of Peiyuan Jieyu Decoction on Chronic Stress BALB/C Miceand Its Regulatory Mechanism on TRY-KYN Metabolism

        Li Haina1, Zhang Jing1, Li Lina2, Fan Angran2, Yu Xue2, Wang Pingping1, Liu Baoxiu1, Chang Hongsheng1

        (1SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2SchoolofPreclinicalMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

        Objective:To study the influence of antidepressant effects of Sini Powder, Tiansi Liquid, and Peiyuan Jieyu Decoction on corticosrone and tryptophan 2, 3-double enzyme (TDO) and key metabolism enzyme of the tryptophan-kynurenine (TRP-KYN) pathway. Methods:The mice model was established by chronic stress. The immobility time in forced swimming test was acquired and analysed by Noldus EthoVision XT9 system. Tryptophane, kynurenine, kynurenic acid, quinaldinic acid and corticosrone in serum were detected by HPLC-MS/MS technique. The mRNA expression level of TDO in liver was detected by real-time PCR. Results:After five days chronic stress, the immobility time of model group mice was prolonged. The serum corticosterone levels, KYN/TRP and KYN/KA specific value increased and KYN/Q specific value decreased. Tiansi Liquid, Sini Powder and Peiyuan Jieyu Decoction could shorten the immobility time of mice (P<0.1). It could also cut the corticosterone levels (P<0.05); increased KYN/TRP and KYN/Q specific value (P<0.05) and reduced the KYN/KA specific value. Conclusion:Sini Powder, Tiansi Liquid and Peiyuan Jieyu Decoction have antidepressant effect. The mechanism may be related to the increase of serum corticosterone induced by stress reaction and the reduce of neurotoxicity during the TRY-KYN metabolim and improvement of nerve protection.

        Sini Powder; Tiansi Liquid; Peiyuan Jieyu Decoction; Anti-depression; TRY-KYN

        國家自然科學(xué)基金項目(編號:81373584)

        暢洪昇(1971.10—),男,博士,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,研究方向:主要從事中藥藥效及作用機(jī)制方面的研究,E-mail:chs1971@sina.com

        R285.5

        A

        10.3969/j.issn.1673-7202.2017.01.037

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