鄭雪芳, 朱育菁, 劉 波, 葛慈斌

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福州 350003)

技術(shù)與應(yīng)用

番茄青枯病植物疫苗膠懸菌劑的制備及其對病害的防治效果

鄭雪芳, 朱育菁, 劉 波*, 葛慈斌

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福州 350003)

研究了植物疫苗膠懸劑的制備工藝,確定膠懸劑制備的適宜參數(shù)為:瓊脂終濃度為2.0‰、氯化鈉終濃度為2.0%和pH為7.0。在此條件下,膠懸效果最好,質(zhì)地均勻,無上下分層。試驗(yàn)了植物疫苗膠懸劑對番茄青枯病的防治效果,結(jié)果表明,該膠懸劑能較好地抑制番茄青枯病的發(fā)生,其防效(77.45%)與化學(xué)農(nóng)藥72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP(77.23%)相當(dāng),配合生防菌劑20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP施用,效果更佳,防效達(dá)81.81%。

番茄青枯病； 青枯雷爾氏菌； 植物疫苗； 膠懸劑

由青枯雷爾氏菌Ralstoniasolanacearum引起的青枯病是番茄種植過程中的主要病害之一,隨著番茄種植面積的不斷擴(kuò)大,以及種植方式和管理技術(shù)的不當(dāng),該病害發(fā)生越來越嚴(yán)重,給番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[1]。長期使用化學(xué)農(nóng)藥防治番茄青枯病,帶來了環(huán)境污染、菌株抗藥性增加和農(nóng)藥殘留等一系列問題[2]。利用青枯雷爾氏菌無致病力菌株作為植物疫苗在番茄育苗時進(jìn)行接種能有效控制青枯菌的侵入,具有無農(nóng)藥殘留,對環(huán)境友好等特點(diǎn),已成為目前作物青枯病防治研究的發(fā)展方向[3]。

筆者在前期研究中篩選到一株對番茄青枯病防效好,性狀穩(wěn)定的青枯雷爾氏菌無致病力菌株FJAT-1458[4],擬利用該菌株研發(fā)青枯病植物疫苗。本研究將菌株FJAT-1458的發(fā)酵液制備成膠懸劑,以期得到性狀穩(wěn)定的菌劑產(chǎn)品,為今后青枯病植物疫苗生防菌制劑規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。同時比較所制備的植物疫苗菌劑與其他生防菌劑及化學(xué)藥劑對番茄青枯病的防治效果,為植物疫苗的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青枯雷爾氏菌無致病力菌株FJAT-1458分離自感染番茄青枯病的田塊中表現(xiàn)健康的植株,由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫收集保存。生物殺菌劑20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌可濕性粉劑,由福農(nóng)生化有限公司提供；化學(xué)農(nóng)藥72%農(nóng)用硫酸鏈霉素可溶粉劑,華北制藥生產(chǎn)。培養(yǎng)青枯雷爾氏菌的固體培養(yǎng)基TTC的配制參照Kelman[5],液體培養(yǎng)基為SPA(蔗糖20 g,蛋白胨5 g,KH2PO40.5 g,MgSO40.025 g,定容至1 L,pH 7.0)。50 L發(fā)酵罐(GUJS-50 L型,鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司)。

1.2 菌株FJAT-1458的發(fā)酵

將菌株FJAT-1458在TTC平板上活化后,轉(zhuǎn)接至SPA液體培養(yǎng)基中,30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)液按1%接菌量接種到裝有30 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,控制發(fā)酵罐攪拌器轉(zhuǎn)速為200 r/min、在28～30℃下發(fā)酵48 h,然后轉(zhuǎn)入無菌容器中,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 發(fā)酵液的耐鹽性測定

在發(fā)酵液中加入NaCl, 設(shè)置發(fā)酵液中NaCl的終濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%和7.0%,以不加NaCl為對照。常溫放置,處理后5 d取樣,涂布TTC平板,培養(yǎng)48 h后,統(tǒng)計(jì)平板上FJAT-1458的活菌數(shù)量。

1.4 發(fā)酵液的耐酸堿性測定

將發(fā)酵液pH分別調(diào)整為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0(用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)酸性,1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)堿性),常溫放置5 d后取樣,涂布TTC平板,30℃培養(yǎng)48 h后,統(tǒng)計(jì)平板上FJAT-1458的活菌數(shù)量,分析FJAT-1458發(fā)酵液對酸堿的耐受力。

1.5 菌株FJAT-1458發(fā)酵液膠懸劑的制備

配制1%瓊脂液,調(diào)pH=7.0,121℃高壓20 min,冷卻至40～50℃時,按瓊脂終濃度為1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰和3.0‰ 將瓊脂液和菌株FJAT-1458發(fā)酵液(pH 7.0,NaCl濃度為2%)混勻,靜置24 h,觀察膠懸劑(含菌量2.0×108cfu/mL)的物理特性(包括均勻度、分層與否等)。

1.6 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在福建省福鼎市蕉宕村綠禾盛有限公司番茄種植大棚,常年發(fā)生青枯病,試驗(yàn)選用的番茄品種為‘蓓盈’。

試驗(yàn)共設(shè)4個處理。(1)植物疫苗膠懸劑處理:番茄育苗時,用植物疫苗膠懸劑100倍液與育苗基質(zhì)按1∶40混合拌勻;移栽時,用植物疫苗膠懸劑500倍液灌根,200 mL/株,之后,每個月再按移栽時的方法灌根1次。(2)生防菌處理:番茄育苗時,用生物殺菌劑20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP 300倍液與育苗基質(zhì)按1∶40混合拌勻;移栽時,用20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP 300倍液灌根,200 mL/株,之后,每個月再按移栽時的方法灌根1次。(3)常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥處理:番茄育苗時,用72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP 2 000倍液與育苗基質(zhì)按1∶40混合拌勻;移栽時,用72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP 5 000倍液灌根,200 mL/株,之后,每個月再按移栽時的方法灌根1次。(4)植物疫苗配合生防菌處理:番茄育苗時,將植物疫苗膠懸劑100倍液與20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP 300倍液按1∶1配成混合液,然后將混合液與育苗基質(zhì)按1∶40混合拌勻;移栽時,將植物疫苗膠懸劑500倍液與20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP 300倍液按1∶1配成混合液,然后用混合液灌根,200 mL/株,之后,每個月再按移栽時的方法灌根1次。以清水代替生防菌劑或化學(xué)農(nóng)藥對番茄苗進(jìn)行同樣處理作為對照。每處理及對照均設(shè)3個重復(fù),每重復(fù)667 m2,田間隨機(jī)排列;處理及對照的水、肥等管理按常規(guī)方法進(jìn)行。處理后90 d(結(jié)果期)進(jìn)行番茄青枯病田間病情調(diào)查,統(tǒng)計(jì)不同處理下番茄青枯病的田間發(fā)病率,計(jì)算各處理的防治效果。發(fā)病率(%)=(發(fā)病株數(shù)/總株數(shù))×100,防效(%)=[1-(發(fā)病株數(shù)/總株數(shù))]×100;同時,調(diào)查植株的株高和掛果率,每處理測量50株,取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株FJAT-1458的耐鹽性

不同鹽濃度處理下,菌株FJAT-1458發(fā)酵液中活菌數(shù)呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律(圖1),在氯化鈉濃度大于5.5%時,菌株FJAT-1458不能存活。添加的氯化鈉濃度為2%時發(fā)酵液中活菌數(shù)與對照相當(dāng),為3.5×108cfu/mL,而氯化鈉濃度在3.0%～5.0%時,菌株FJAT-1458發(fā)酵液中菌體數(shù)量隨鹽濃度增加而減少,說明在FJAT-1458發(fā)酵液中添加一定量的氯化鈉(2%)有利于菌株的存活,但添加量過多也會導(dǎo)致菌株FJAT-1458的死亡。

2.2 菌株FJAT-1458的耐酸堿性

菌株FJAT-1458的發(fā)酵液在pH 7～8條件下菌體數(shù)最多,在弱堿性(pH為9)條件下能存活,但活菌數(shù)量明顯低于中性條件,在pH大于10和小于4條件下均不能存活,在弱酸性pH 4～6條件下能存活,菌量大于其在弱堿性條件下的存活量(圖2)。

圖1 不同NaCl濃度對菌株FJAT-1458生長的影響Fig.1 Effects of different NaCl concentrations on the growth of strain FJAT-1458

2.3 菌株FJAT-1458的膠懸劑制備

在菌株FJAT-1458的發(fā)酵液(pH 7.0,NaCl濃度2%)中添加不同濃度的水瓊脂,制備植物疫苗膠懸劑,結(jié)果表明,瓊脂終濃度為1‰的膠懸劑會上下分層,瓊脂終濃度為3‰時會凝固成塊,瓊脂終濃度為2.5‰的膠懸劑出現(xiàn)較大的顆粒狀,瓊脂終濃度為1.5‰和2‰的膠懸劑效果最好,質(zhì)地均勻,無上下分層(圖3)。

圖3 不同瓊脂濃度下植物疫苗膠懸劑的表觀性狀Fig.3 Colloidal suspension characters of plant vaccine under different agar concentrations

2.4 不同處理對番茄植株田間生長的影響

由表1可見,植株疫苗處理的番茄植株的株高(48.41 cm)略高于生防菌劑20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP處理(46.83 cm)、植物疫苗配合20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP處理(46.54 cm)及對照組的番茄植株的株高(46.54 cm),但他們之間差異不顯著。72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP處理對番茄植株生長有一定的抑制作用,株高為40.68 cm,顯著低于上述各種處理及對照。

植物疫苗處理的番茄植株的掛果數(shù)與植物疫苗配合20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP處理及對照組相當(dāng),分別為25.80、25.40和25.20個；20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP處理和72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP處理的番茄植株掛果數(shù)分別為21.40和20.20個,顯著低于植物疫苗、植物疫苗配合20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP和對照組番茄植株的掛果數(shù)。

表1 不同處理下番茄植株生長情況1)

Table 1 Growth of tomato plants under different treatments

處理Treatment株高/cmPlantheight掛果數(shù)/個·株-1Fruitquantity植物疫苗 Plantvaccine(48.41±2.46)a(25.80±1.92)a20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP 2×109spores/gBacilluscereusWP(46.83±2.08)a(21.40±1.82)b72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP 72%streptomycinSP(40.68±2.80)b(20.20±1.92)b植物疫苗+20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WPPlantvaccine+2×109spores/gBacilluscereusWP(46.54±2.80)a(25.40±1.14)a對照 Negativecontrol(46.54±1.79)a(25.20±1.79)a

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。 Data in the table are average value±SD, different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.The same below.

2.5 不同處理對番茄植株發(fā)病率的影響

植物疫苗、生防菌劑20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP和化學(xué)農(nóng)藥72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP對番茄青枯病的防治效果不同,植物疫苗配合20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP處理對番茄青枯病的防效最好,達(dá)81.81%,其次是植物疫苗單獨(dú)處理,其對番茄青枯病的防效為77.45%,與72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP的防效(77.23%)相當(dāng),20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP單獨(dú)處理對番茄青枯病的防效(72.77%)低于植物疫苗和72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP處理,但差異不顯著(表2)。

表2 不同處理下番茄青枯病發(fā)病率

Table 2 Disease incidences of tomato bacterial wilt under different treatments

處理Treatment番茄總數(shù)/株Totalnumberoftomatoplant發(fā)病率/%Diseaseincidence防效/%Controlefficacy植物疫苗 Plantvaccine234(2.12±0.21)b(77.45±1.25)a20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP 2×109spores/gBacilluscereusWP234(2.56±0.09)b(72.77±1.65)a72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP 72%streptomycinSP234(2.14±0.13)b(77.23±2.58)a植物疫苗+20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WPPlantvaccine+2×109spores/gBacilluscereusWP234(1.71±0.07)b(81.81±1.96)a對照 Negativecontrol234(9.40±1.18)a-

3 討論

膠懸劑又叫懸浮劑,是以水為介質(zhì),以表面活性劑等作分散物,利用濕法進(jìn)行超微粉碎制成的黏稠可流動的懸浮液,具有粒子小、表面活性大、藥效高、滲透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。膠懸劑在化學(xué)農(nóng)藥生產(chǎn)中應(yīng)用較多,一些農(nóng)藥膠懸劑已實(shí)現(xiàn)商品化[6],如40%多菌靈膠懸劑[7],在一些生物制劑中也有商品化應(yīng)用,如美國陶氏化學(xué)有限公司在中國登記的2.5%多殺菌素膠懸劑(商品名菜喜)是從土壤放線菌次生代謝物中分離提純出來的一種新型殺蟲劑[8]。目前常用的農(nóng)藥膠懸劑的表面活性劑有:(1)非離子型,如烷基酚聚氧乙烯醚類等；(2)陰離子表面活性劑,如烷基苯磺酸鹽類等；(3)陽離子表面活性劑,如烷基銨鹽型等。本研究利用瓊脂的膠懸作用,將植物疫苗菌株FJAT-1458的發(fā)酵液制備成膠懸劑,結(jié)果表明,當(dāng)瓊脂濃度為1.5‰或2‰時,制備的植物疫苗膠懸劑的膠懸效果最好,質(zhì)地均勻,無大顆粒出現(xiàn)、無上下分層,可以在后期的產(chǎn)品制備時應(yīng)用,該方法制備的植物疫苗膠懸劑具有操作簡單、制作成本低、使用方便,對環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)。

在生物制劑中添加適量的氯化鈉可阻止其受到雜菌的污染。還可起到調(diào)節(jié)菌體細(xì)胞滲透壓的作用,使菌體濃度維持一定的穩(wěn)定性,但是氯化鈉濃度不能過高,否則會抑制菌的生長和活性。本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)植物疫苗菌株FJAT-1458的發(fā)酵液中添加鹽的濃度為2%時,所含F(xiàn)JAT-1458的活菌量最多,但隨著鹽濃度的增加,FJAT-1458的生長受到抑制,鹽濃度超過5.5%時,FJAT-1458完全不能生長,因而建議在進(jìn)行植物疫苗菌劑的制備時鹽的添加量控制在2%以內(nèi),這樣可以更好地保持菌的活性。

pH(酸堿度)是影響微生物生長的重要因素,與微生物的生命活動有著密切的聯(lián)系。pH不僅會影響微生物細(xì)胞膜所帶的電荷,進(jìn)而影響細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)吸收,此外,它還通過改變培養(yǎng)基中一些有機(jī)化合物的離子化程度,而改變其溶解性,從而促進(jìn)或抑制微生物的生長[9]。大部分微生物適宜在中性環(huán)境下生長,本研究發(fā)現(xiàn)植物疫苗菌株FJAT-1458的發(fā)酵液在pH 7～8的中性條件下活菌數(shù)最多,pH大于10和小于4均會抑制菌株生長。

番茄青枯病植物疫苗膠懸劑能較好地抑制番茄青枯病的發(fā)生,其防效與化學(xué)農(nóng)藥72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP相當(dāng),配合生防菌劑20億活芽孢/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP施用,效果更佳。植物疫苗制劑對番茄植株具有促進(jìn)生長作用,單獨(dú)施用或配合生防菌施用,番茄植株的株高和掛果率均顯著高于72%農(nóng)用硫酸鏈霉素SP處理,說明植物疫苗制劑本身對番茄植株不會產(chǎn)生藥害,具有安全無毒、無藥殘、對環(huán)境友好,符合無公害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn),可以在生產(chǎn)上應(yīng)用。

[1] Hibberd A M, Heaton J B, Finlay G P, et al. A plastic film greenhouse method for selecting tomato seedlings resistance to bacterial canker [J]. Plant Disease, 1992, 76(10): 1004-1007.

[2] 肖燁, 洪艷云, 易圖永, 等. 番茄青枯病生物防治研究進(jìn)展[J]. 植物保護(hù), 2007, 33(2): 15-20.

[3] 邱德文. 植物免疫與植物疫苗——研究與實(shí)踐[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2008.

[4] 鄭雪芳, 劉波, 林乃銓, 等. 青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株的構(gòu)建及其防效評價(jià)模型分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2013, 43(5): 518-531.

[5] Kelman A. The relationship of pathogenicity inPseudomonassolanacearumto colony appearance on a tetrazolium medium[J]. Phytopathology, 1954, 44: 693-695.

[6] 章大詡, 王廣遠(yuǎn). 滅蚊球孢菌膠懸劑的研制[J]. 農(nóng)藥, 1997, 36(4): 12-14.

[7] 姚浩然, 李勇, 李靜, 等. 殺菌劑新劑型——“40%多菌靈膠懸劑”防治大豆灰斑病研究[J]. 大豆科學(xué), 1989, 8(1): 75-85.

[8] 劉敏艷, 李玉奇, 胡冠芳. 2.5%菜喜膠懸劑對甘藍(lán)小菜蛾和菜青蟲的防效[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技, 2007(8): 19-21.

[9] 陳燕飛. pH對微生物的影響[J]. 太原師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009, 8(3): 121-124.

(責(zé)任編輯:楊明麗)

Preparation of colloidal suspension agent used as plant vaccine against tomato bacterial wilt disease and its control efficacy

Zheng Xuefang, Zhu Yujing, Liu Bo, Ge Cibin

(AgriculturalBio-ResourcesInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003,China)

The preparation technology of the plant vaccine agent was investigated in this paper. The results showed that the suitable parameters for the plant vaccine agent were 2‰ final concentration of agar, 2% final concentration of NaCl and pH 7.0. Under this condition, the agent had the best colloidal suspension with uniform texture. The control efficacy against tomato bacterial wilt disease were compared among plant vaccine agent, biocontrol agent 2×109spores/gBacilluscereusWP and 72% streptomycin SP. The results indicated that the control efficacy of plant vaccine agent was 77.45%, equal to that of 72% streptomycin SP (77.23%). The plant vaccine agent combined with biocontrol agent 2×109spores/gBacilluscereusWP had the best control effect, with the efficacy of 81.81%.

tomato bacterial wilt disease;Ralstoniasolanacearum; plant vaccine; colloidal suspension agent

2016-03-28

2016-04-25

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303015)；福建省自然科學(xué)基金(2015J01103)；福建省公益類科研院所專項(xiàng)(2014R1018-8)

S435.72; S476

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.037

Technology & Application

* 通信作者 E-mail: fzliubo@163.com