楊 婷, 史紅安, 李聰麗, 李建華,王立華, 李國元, 張志林*

(1. 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,孝感 432000；2. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢 430062)

13種萜類化合物對膠孢炭疽菌和鏈格孢的抑制活性

楊 婷1,2, 史紅安1,2, 李聰麗1,2, 李建華1,王立華1, 李國元1, 張志林1*

(1. 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,孝感 432000；2. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢 430062)

炭疽菌Colletotrichum和鏈格孢Alternaria是引起植物病害的重要真菌,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失。本研究選取13種萜類化合物,采用菌絲生長速率法對膠孢炭疽菌、鏈格孢進(jìn)行抑菌活性分析。研究結(jié)果表明:香芹酚、丁香酚、異丁香酚、枯茗醛、百里香酚對兩種病原菌有較好的抑菌活性,其中香芹酚對膠孢炭疽菌和鏈格孢的抑菌活性最強(qiáng),IC50分別為40.89 μg/mL和18.19 μg/mL。本試驗(yàn)為植物精油和天然殺菌劑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

萜類化合物； 抑菌活性； 膠孢炭疽菌； 鏈格孢

炭疽菌Colletotrichum和鏈格孢Alternaria引起的植物病害,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失[1-2]。在長期的選擇壓力下,病原菌抗藥性不斷增強(qiáng),常用藥劑防治效果逐年下降。因此,尋找新型農(nóng)藥、加強(qiáng)病原菌抗藥性治理成為病害綜合防治的迫切需要。

精油是從植物中提取的具有揮發(fā)性、分子量較小的次生代謝物質(zhì)[3]。其成分較為復(fù)雜,包含芳香族化合物、脂肪族化合物、萜類化合物、含硫含氮化合物及其含氧衍生物如酮、酚、醛、醇、酸、酯等[4]。研究表明:精油具有抑菌活性強(qiáng)、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn),是一種安全有效的天然殺菌劑[5-7]。本文選取酮、酚、醛等13種萜類化合物,研究其對膠孢炭疽菌和鏈格孢的活性,篩選活性好的萜類化合物,以期為植物提取物的利用和天然殺菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試萜類化合物

丁香酚 (eugenol)、百里香酚(thymol)、香芹酚 (carvacrol)、異丁香酚(isoeugenol)、薄荷酮[(-)-menthone]、香芹酮[(-)-carvone]、長葉薄荷酮[(+)-pulegone]、馬鞭草烯酮[(-)-verbenone]、小茴香酮[(-)-fenchone]、莰酮[(+)-camphor]、檸檬醛(citral)、香茅醛(citronellal)、枯茗醛(cuminaldehyde)均購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,純度大于95%。

1.1.2 病原菌

膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和鏈格孢Alternariasp.從湖北孝感市區(qū)油茶病株上采集,利用常規(guī)組織分離法分離純化病原菌,觀察其形態(tài)學(xué)特征,結(jié)合其 rDNA-ITS 序列分析對病原菌進(jìn)行分子鑒定[8]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萜類化合物抑菌活性的測定

采用菌絲生長速率法測定萜類化合物的抑菌活性。在無菌條件下,將滅菌的PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、純凈水1 000 mL)冷卻至50℃左右,將40 mg萜類化合物加入100 mL培養(yǎng)基中,配成濃度為400 μg/mL的混合物,充分搖勻,倒入直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中,每皿大約20 mL。用6 mm的打孔器在培養(yǎng)好的供試菌菌落邊緣打取長勢相同的菌餅接入培養(yǎng)皿中央,每皿一枚,3次重復(fù),以PDA為空白對照。倒置培養(yǎng),培養(yǎng)條件為28℃。待對照長滿培養(yǎng)皿后,用十字交叉法測量菌落直徑,計(jì)算萜類化合物對供試菌的抑制率。

1.2.2 不同濃度萜類化合物抑菌活性的測定

將1.2.1測定的抑菌率大于50%的萜類化合物進(jìn)行不同濃度梯度活性測定,濃度梯度為50、100、200、400 μg/mL,方法同1.2.1。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。抑菌率用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異多重比較(P<0.05)。IC50利用SPSS軟件中回歸分析的Probit進(jìn)行計(jì)算。

抑菌率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑-菌餅直徑] ×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 13種萜類化合物對兩種病菌菌絲生長的抑制作用

以菌絲生長速率法測定13種萜類化合物對膠孢炭疽菌和鏈格孢菌絲生長的抑制作用。結(jié)果(表1)表明除薄荷酮、莰酮和香茅醛對膠孢炭疽菌無抑菌活性;小茴香酮、薄荷酮和香芹酮對鏈格孢無抑菌活性外,其他精油對兩種病菌均具有抑制活性,其中丁香酚和香芹酚的抑菌效果最好,對2種病原菌的抑菌率均為100%。其次為異丁香酚、枯茗醛和百里香酚。

表1 13種萜類化合物(400 μg/mL)對兩種病菌的抑菌活性1)

Table 1 Antifungal activity of 13 terpenoid compounds (400 μg/mL) againstColletotrichumgloeosporioidesandAlternariasp.

化合物Compound平均抑菌率±標(biāo)準(zhǔn)誤/%Averageinhibitionrate±SE膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides鏈格孢Alternariasp.丁香酚Eugenol(100±0.00)a(100±0.00)a百里香酚Thymol(62.18±0.44)c (61.37±0.97)d 香芹酚Carvacrol(100±0.00)a(100±0.00)a異丁香酚Isoeugenol(100±0.00)a(84.54±0.89)b 莰酮(-)-Camphor(0.00±0.00)h (2.60±0.16)h 小茴香酮(-)-Fenchone(3.91±0.44)g (0.00±0.00)i 馬鞭草烯酮(-)-Verbenone(36.17±0.30)e (2.10±1.37)h 長葉薄荷酮(+)-Pulegone(38.85±0.70)d (44.27±0.14)f 香芹酮(-)-Carvone(4.19±0.15)g (0.00±0.00)i 薄荷酮(-)-Menthone(0.00±0.00)h (0.00±0.00)i 檸檬醛Citral(23.49±0.24)f (50.46±0.73)e 香茅醛Citronellal(0.00±0.00)h (16.63±0.82)g 枯茗醛Cuminaldehyde(65.56±0.51)b (66.67±0.59)c

1) 同列不同字母代表差異顯著(P<0.05)。 The different letters in the same column represent significant difference (P<0.05).

2.2 優(yōu)選出的5種萜類化合物對兩種病菌的IC50

根據(jù)2.1結(jié)果，香芹酚、異丁香酚等5種萜類化合物在濃度400 μg/mL時(shí)具有較好的抗病菌活性,為了進(jìn)一步探索其抑菌活性,將選出來的5種萜類化合物進(jìn)行濃度梯度活性試驗(yàn),測定其對膠孢炭疽菌和鏈格孢的抑菌率,結(jié)果(圖1～2)表明:這5種萜類化合物對膠孢炭疽菌菌絲生長抑制活性為:香芹酚>丁香酚>異丁香酚>枯茗醛>百里香酚,其對應(yīng)的IC50(表2)分別為40.89、42.95、88.86、170.58、348.56 μg/mL。經(jīng)5種萜類化合物不同濃度梯度處理后菌落生長情況見圖3。精油對鏈格孢菌絲生長抑制活性為:香芹酚>異丁香酚>丁香酚>枯茗醛>百里香酚,其對應(yīng)的IC50分別為18.19、22.43、114.64、339.35、384.65 μg/mL。

圖1 5種萜類化合物對膠孢炭疽菌的抑菌活性Fig.1 Antifungal activity of five terpenoid compounds against Colletotrichum gloeosporioides

圖2 5種萜類化合物對鏈格孢的抑菌活性Fig.2 Antifungal activity of five terpenoid compounds against Alternaria sp.

化合物Compound膠孢炭疽菌ColletotrichumgloeosporioidesIC50/μg·mL-1χ2鏈格孢Alternariasp.IC50/μg·mL-1χ2異丁香酚Isoeugenol88.86(62.46～110.45)21.1922.43(8.63～37.02)2.49丁香酚Eugenol42.95(11.56～69.23)36.57114.64(107.70～121.72)1.24香芹酚Carvacrol40.89(32.48～47.09)17.5818.19(4.00～30.48)26.26枯茗醛Cuminaldehyde170.58(141.23～210.15)23.19339.35(305.52～382.79)32.40百里香酚Thymol348.56(310.27～365.87)13.41384.65(368.08～392.90)1.60

圖3 5種萜類化合物不同濃度對膠孢炭疽菌和鏈格孢的抑菌活性Fig.3 Antifungal activity of five terpenoid compounds at different concentrations on the Colletotrichum gloeosporioides and Alternaria sp.

3 討論

本文研究了13種萜類化合物的抑菌活性,結(jié)果表明:香芹酚、丁香酚、異丁香酚、枯茗醛、百里香酚對兩種病原菌的抑菌活性較好,其中抑菌活性最好的是香芹酚。

香芹酚,又名香芹芥酚,它是百里香油、牛至油、山地椒油等植物提取物的主要成分。因其具有抑菌、殺蟲、抗氧化等作用[9-11],引起人們的關(guān)注。王新偉等[12-13]采用紙片擴(kuò)散法和雙倍稀釋法研究發(fā)現(xiàn)香芹酚對大腸桿菌Escherichia coli和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、面包酵母Saccharomyces cerevisiae、黑曲霉Aspergillus niger均有明顯的抑制作用。Ultee等[14]研究發(fā)現(xiàn)香芹酚可以改變枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis細(xì)胞膜中脂肪酸的結(jié)構(gòu)和比例,從而抑制其生長。香芹酚不但對植物病害具有一定的抑制活性,對植物蟲害同樣具有活性,如王玲等[15]研究發(fā)現(xiàn)香芹酚對黏蟲有較好的毒殺活性,用其處理24h后的半致死濃度(LC50)為12.7mg/L。張靜等[16]研究發(fā)現(xiàn)香芹酚對朱砂葉螨有較強(qiáng)的毒殺活性,在供試濃度為1g/L時(shí),處理24h后其校正死亡率達(dá)到100%,還可以抑制朱砂葉螨產(chǎn)卵,產(chǎn)卵抑制率高達(dá)87.95%。

本文首次發(fā)現(xiàn)香芹酚對膠孢炭疽菌、鏈格孢具有抑制活性,這不僅為下一步研究其抑菌機(jī)制和作用方式奠定基礎(chǔ),也為將香芹酚開發(fā)成天然殺菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

[1] 高芬, 吳元華. 鏈格孢屬(Alternaria)真菌病害的生物防治研究進(jìn)展[J]. 植物保護(hù), 2008, 34(3):1-6.

[2] 劉曉云, 景耀, 楊俊秀. 植物炭疽菌研究文獻(xiàn)綜述[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 1995(4):105-111.

[3] 胡林峰, 許明錄, 朱紅霞. 植物精油抑菌活性研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2011,23(2): 384-391.

[4] 王巨媛, 翟勝. 植物精油應(yīng)用進(jìn)展及開發(fā)前景展望[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(4): 1-3.

[5] 李永剛, 文景芝, 郝中娜. 植物源殺菌劑的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 33(2): 198-202.

[6] 王樹桐, 曹克強(qiáng), 張鳳巧, 等. 中藥丁香提取物對番茄灰霉病菌抑制作用及生防效果[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2005, 35(6): 91-94.

[7]DiVaioC,GrazianiG,GaspariA,etal.Essentialoilscontentandantioxidantpropertiesofpeelethanolextractin18lemoncultivars[J].ScientiaHorticulturae, 2010, 126(1): 50-55.

[8] 史紅安, 傅本重, 張志林, 等. 侵染油茶的兩種病原菌的鑒定及其生物學(xué)特性研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015(23):5908-5911.

[9]LambertRJ,SkandamisPN,CootePJ,etal.Astudyoftheminimuminhibitoryconcentrationandmodeofactionoforeganoessentialoil,thymolandcarvacrol[J].JournalofAppliedMicrobiology, 2001, 91(3): 453-462.

[10]ChamiN,BennisS,ChamiF,etal.Studyofanticandidalactivityofcarvacrolandeugenolin vitroandin vivo [J].OralMicrobiology&Immunology, 2005, 20(2): 106-111.

[11]王新偉,崔言開,田雙起,等.牛至油、香芹酚、檸檬醛和肉桂醛的抗氧化性能研究[J].食品工業(yè)科技,2013,14(34):311-313.

[12]王新偉, 劉歡, 魏靜, 等. 牛至油、香芹酚、檸檬醛和肉桂醛抑菌作用研究[J]. 食品工業(yè), 2010(5): 13-16.

[13]王新偉, 杜會云, 宋玉函, 等. 牛至油、香芹酚、檸檬醛和肉桂醛抗真菌研究[J]. 食品科技, 2011, 36(2): 193-196.

[14]UlteeA,KetsEPW,AlberdaM,etal.Adaptationofthefood-bornepathogenBacillus cereustocarvacrol[J].ArchivesofMicrobiology, 2000, 174(4): 233-238.

[15]王玲,諶曉洪. 香芹酚對粘蟲的毒殺活性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(16): 8488-8490.

[16]張靜,馮崗.11 種丙基酚類物質(zhì)對朱砂葉螨的殺螨活性[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 26(17): 285-288.

(責(zé)任編輯:楊明麗)

Antifungal activity of 13 terpenoid compounds againstColletotrichumgloeosporioidesandAlternariasp.

Yang Ting1,2, Shi Hongan1,2, Li Congli1,2, Li Jianhua1, Wang Lihua1, Li Guoyuan1, Zhang Zhilin1

(1．HubeiKeyLaboratoryofQualityControlofCharacteristicFruitsandVegetables,CollegeofLifeScienceandTechnology,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan432000,China; 2．CollegeofLifeScience,HubeiUniversity,Wuhan430062,China)

ColletotrichumandAlternariaare the important plant pathogenic fungi, which have caused great loss to agricultural production. 13 terpenoid compounds were selected to test their antifungal activity onColletotrichumgloeosporioidesandAlternariasp. by mycelium growth rate method. The results showed that carvacrol, eugenol, isoeugenol, cuminaldehyde and thymol had good antimicrobial activities on the two pathogens, and the antifungal activity of carvacrol was the strongest with the IC50values of 40.89 μg/L and 18.19 μg/L, respectively. The results provide theory basis for development and utilization of the plant essential oil and natural fungicide.

terpenoid compounds; antifungal activity;Colletotrichumgloeosporioides;Alternariasp.

2016-04-24

2016-07-25

湖北省自然科學(xué)基金(2014CFB571)；湖北省教育廳科研項(xiàng)目(B2016185，D20102704)

S432

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.034

* 通信作者 E-mail: zhangzhilin913@sina.com