李海云, 靳 帥, 張學(xué)勤, 范光輝, 張建新, 許艷霞

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局京唐港辦事處, 唐山 063611)

大豆炭疽病菌Colletotrichumchlorophyti的鑒定

李海云*, 靳 帥, 張學(xué)勤, 范光輝, 張建新, 許艷霞

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局京唐港辦事處, 唐山 063611)

從進(jìn)口的烏拉圭大豆的殘留莖稈上分離到一種新的大豆炭疽病菌,根據(jù)菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)、ITS序列及ACT序列特征以及對(duì)大豆的致病性,將其鑒定為Colletotrichumchlorophyti,這是我國口岸首次截獲該菌。

大豆; 炭疽病菌; 分離; 鑒定

炭疽菌ColletotrichumCorda是重要的世界性植物病原真菌。由該屬一些種引起的大豆炭疽病在巴西、印度、南美及中國臺(tái)灣及內(nèi)地普遍發(fā)生,導(dǎo)致大豆減產(chǎn)16%～100%[1-3]。該病從苗期至收獲期均可發(fā)病,苗期引起大豆死苗,成株期可危害莖稈、豆莢,導(dǎo)致大豆品質(zhì)變劣,產(chǎn)量下降。據(jù)報(bào)道,能夠引起大豆炭疽病的病原菌有平頭炭疽菌C.truncatum、毀滅炭疽菌C.destructivum、毛核炭疽菌C.coccodes、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides及禾谷炭疽菌C.graminicola[4-6]。美國科學(xué)家于2009年從阿拉巴馬州、伊利諾伊州及密西西比州大豆葉柄中首次分離得到C.chlorophyti,2012年報(bào)道該菌侵染大豆,引起大豆炭疽病,隨后2013年發(fā)現(xiàn)該菌可以侵染大豆種子[7-8]。但目前國內(nèi)尚未有該菌分布的報(bào)道,口岸亦沒有相關(guān)截獲報(bào)道。

2015年9月,我們?cè)趯?duì)進(jìn)境烏拉圭大豆進(jìn)行檢疫時(shí),發(fā)現(xiàn)類似炭疽病癥狀的豆稈,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)、形態(tài)和分子特征鑒定及致病性測(cè)定,確認(rèn)該菌為Colletotrichumchlorophyti,這是我國首次截獲并報(bào)道該病菌。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

從烏拉圭進(jìn)境大豆中,選取有病斑或表面帶小黑點(diǎn)等可疑癥狀的莖稈及豆莢,1.25%次氯酸鈉表面消毒10 min,無菌水洗3 次,置于PDA 平板上,25℃、12 h光暗交替培養(yǎng),3 d后觀察豆莢、莖稈周圍是否有菌落產(chǎn)生,并將菌絲移入新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2 分離物鑒定

1.2.1 形態(tài)鑒定

將病菌分離物置于PDA培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落形狀及色澤,取菌絲制片觀察和成像。顯微鏡下觀察記錄厚垣孢子和分生孢子形態(tài)特征。

1.2.2 分子鑒定

將病菌分離物菌絲塊移至PDA上,25℃培養(yǎng)7 d后收集菌絲,液氮冷凍后研磨。取0.1 g菌絲粉用植物基因組提取試劑盒(Tiangen BioTech)提取DNA。用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ACT512F(5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′)/ACT783R(5′-TA-CGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′)[9]分別擴(kuò)增 ITS和ACT基因序列。PCR反應(yīng)總體積為50 μL:25 μLTaqPCR Mastermix(Tiangen BioTech),1 μL上游引物(10 μmol/L),1 μL下游引物(10 μmol/L),2 μL模板DNA,加水至50 μL。反應(yīng)循環(huán)程序?yàn)?94℃ 4 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);最后 72℃ 10 min。取 5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)分析。PCR產(chǎn)物送北京金唯智生物科技有限公司測(cè)序,所得序列經(jīng)核實(shí)后,去除引物序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析。將獲得序列與GenBank中其他炭疽菌屬相關(guān)序列,用MEGA 5.0程序進(jìn)行比對(duì),采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹,進(jìn)行1 000次重復(fù)抽樣計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的置信度。

1.3 致病性測(cè)定

1.3.1 莖稈傷口接種

取烏拉圭進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆種子(GTS40-3-2品系及MON87701×89788品系)種植于營養(yǎng)土中,25℃光照條件下培養(yǎng)4周備用。在菌齡1周的培養(yǎng)皿中加入5 mL滅菌水,振蕩,獲得濃度約為107cfu/mL的分生孢子懸浮液。在大豆幼苗下胚軸劃一傷口,針刺接種分生孢子懸浮液，3次重復(fù)，每次至少接種5株幼苗，從無菌水作對(duì)照接種,接種后置于密封塑料袋中25℃保濕培養(yǎng)1 d,1～2周內(nèi)觀察記錄發(fā)病癥狀。

1.3.2 葉片傷口接種

取健康大豆種子‘中黃13’種植于營養(yǎng)土中,25℃光照條件下培養(yǎng)4周備用。在菌齡1周的培養(yǎng)皿中加入5 mL滅菌水,獲得濃度約為107cfu/mL的分生孢子懸浮液。采用針刺法接種幼葉,重復(fù)3次,每次至少接種5株幼苗，25℃保濕培養(yǎng)1 d,1～2周內(nèi)觀察記錄發(fā)病癥狀,對(duì)照用無菌水接種。1～2周后將接菌的莖稈和葉片經(jīng)表面消毒后再分離病菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上,分離物菌落圓形,氣生菌絲氈狀或絨狀,緊貼培養(yǎng)基生長,菌落邊緣整齊,呈灰白色,培養(yǎng)3 d后菌絲開始變黑,10 d后黑色菌落滿皿(圖1a～b)。培養(yǎng)3 d后開始產(chǎn)生厚垣孢子,厚垣孢子單生或串生于菌絲頂端或中間,黃褐色至黑褐色,多數(shù)球形,光滑,大小(平均)7.5 μm×7.5 μm。分生孢子單胞,無色,新月形或鐮刀狀,一端尖銳,另一端較鈍,大小(平均)19 μm×4.8 μm(圖1c～d),無附著胞產(chǎn)生。

圖1 Colletotrichum chlorophyti分離物形態(tài)特征Fig.1 Morphology of Colletotrichum chlorophyti

2.2 分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 ITS序列分析

利用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4對(duì)分離物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),PCR產(chǎn)物送北京金唯智生物科技有限公司測(cè)序,獲得538 bp序列 (GenBank登錄號(hào):KU594267)。將序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blastn比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)序列與Colletotrichumchlorophyti(KT207464,KR052084,KC790962,JX126475,KC110786,NR_111460,GU227894和GU227895)的序列相似性為100%。與C.truncatum(DQ195714和DQ195715)的序列相似性為100%,與C.phaseolorum(NR_119771和GU227896)的序列相似性為99.21%,與C.metake(AB738859)的序列相似性為99.92%,說明分離物與C.chlorophyti和C.truncatum的親緣關(guān)系較近。

2.2.2 ACT序列分析

為進(jìn)一步明確分離物的種群分類地位,以actin為內(nèi)參基因進(jìn)行序列分析。采用引物ACT512F/ACT783R對(duì)分離物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序,獲得215 bp序列(GenBank登錄號(hào):KU985441),并進(jìn)行BLAST分析。結(jié)果表明,分離物與GenBank中C.chlorophyti(KC110822,JX126476,GU227993和GU227992)序列相似性為99.03%～100%,與C.phaseolorum(GU227994和GU227995)的序列相似性為88.52%～89.52%,與C.truncatum(GU227960)的序列相似性為71.90%。采用MAGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)分離物與C.chlorophyti在一個(gè)分支,且Bootstrap支持率為100%(圖2)。

圖2 基于ACT序列采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 A phylogenetic tree resulted from analysis of the ACT sequences by using the NJ method

2.3 致病性測(cè)定

將分離物接種大豆幼苗均可使植株發(fā)病,發(fā)病率為100%。接菌幼苗莖稈2周后,接種處產(chǎn)生潰瘍斑,對(duì)照植株除接種處變褐外,無潰瘍斑(圖3a)。針刺接種葉片5 d后,在接種處產(chǎn)生明顯的壞死斑,病斑周圍深褐色,中央淺褐色,對(duì)照葉片僅接種處有傷口,未變色(圖3b)。根據(jù)柯赫氏法則,對(duì)發(fā)病植株和對(duì)照株進(jìn)行病原菌分離,所有發(fā)病部位均分離得到與接種菌菌落形態(tài)一致的分離物,而對(duì)照植株上沒分離到接種菌(圖3c)。

圖3 病原分離物的致病性測(cè)定Fig.3 Pathogenicity test of pathogenic isolate

通過病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定、致病性測(cè)定和分子生物學(xué)分析結(jié)果,我們將分離物鑒定為C.chlorophyti。

3 討論

自2012年,Yang等首次報(bào)道C.chlorophyti能夠侵染大豆[7],引起大豆炭疽病以來,我國口岸尚沒有該菌的截獲報(bào)道。本研究對(duì)進(jìn)境大豆莖稈上的病菌分離物進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該分離物與C.chlorophyti一致。

傳統(tǒng)的炭疽菌屬分類主要依靠形態(tài)學(xué)特征,包括分生孢子和附著胞的大小和形狀,剛毛和菌核的有無,菌落顏色,生長速度,培養(yǎng)條件等[4,10]。然而,在環(huán)境影響下,炭疽菌屬真菌在形態(tài)及表型上存在差異,形態(tài)學(xué)特征并不能充分區(qū)別各菌種。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,免疫學(xué)方法、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(randomly amplified polymorphic DNAs,RAPDs)、rDNA-ITS技術(shù)等已經(jīng)廣泛用于炭疽菌的鑒定。然而,采用真菌公認(rèn)的DNA條形碼基因核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)不能充分地區(qū)分炭疽菌屬內(nèi)各物種,目前,actin(ACT)、β-tubulin(TUB2)、calmodulin(CAL)、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GPDH)及rDNA-ITS(ITS)5對(duì)基因已用于炭疽菌屬的種群鑒定[11]。本研究中選取ITS和ACT兩個(gè)基因進(jìn)行分子鑒定,結(jié)果顯示ITS序列不能有效區(qū)分C.chlorophyti和C.truncatum,在ACT序列的聚類圖中,分離菌與C.chlorophyti在一個(gè)分支上,且自展支持率為100%。因此,綜合形態(tài)及分子鑒定結(jié)果,可以確定該分離物為C.chlorophyti。

迄今,大豆炭疽病的病原菌報(bào)道最多的是C.truncatum,而多個(gè)炭疽菌種通常可以侵染同一寄主[12],因此,每種病菌的致病作用不可忽視。目前,國內(nèi)外對(duì)C.chlorophyti的研究報(bào)道極少,僅有該菌侵染大豆及其qPCR分子檢測(cè)方面的報(bào)道。我國是重要的大豆進(jìn)口國,病害隨進(jìn)口傳播與擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)極高, 因此,下一步將對(duì)大豆炭疽病菌C.chlorophyti的生物學(xué)特性、致病性分化、快速檢測(cè)及有效防治等進(jìn)行詳細(xì)研究,為該菌的檢疫及病害防治提供理論指導(dǎo)。

[1] Backman P A,Williams J C,Crawford M A.Yield losses in soybeans from anthracnose caused byColletotrichumtruncatum[J].Plant Disease,1982,66:1032-1034.

[2] Manandhar J B,Hartman G L.Anthracnose [M]∥Hartman G L,Sinclair J B,Rupe J C.Compendium of soybean diseases.St.Paul,MN:APS Press,1999:13-14.

[3] Wrather J A,Koenning S R.Estimates of disease effects on soybean yields in the United States 2003 to 2005 [J].Journal of Nematology,2006,38(2):173-180.

[4] Tiffany L H, Gilman J C.Species ofColletotrichumfrom legumes [J]. Mycologia, 1954, 46(1):52-75.

[5] Roy K W. Seedling diseases caused in soybean by species ofColletotrichumandGlomerella[J]. Phytopathology, 1982, 72(8):1093-1096.

[6] Manandhar J B, Hartman G L, Sinclair B.Colletotrichumdestructivum, the anamorph ofGlomerellaglycines[J]. Phytopathology, 1986, 76(3):282-285.

[7] Yang H C, Haudenshield J S, Hartman G L. First report ofColletotrichumchlorophyticausing soybean anthracnose[J]. Plant Disease, 2012, 96(11):1699.

[8] Yang H C, Stewart J M, Hartman G L. First report ofColletotrichumchlorophytiinfecting soybean seed in Arkansas, United States [J]. Plant Disease, 2013, 97(11):1510.

[9] Carbone I, Kohn L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes[J]. Mycologia, 1999, 91(3): 553-556.

[10]Sutton B C.The genusGlomerellaand its anamorphColletotrichum[M]∥Bailey J A,Jeger M J.Colletotrichum: biology,pathology and control.CABI,1992:1-26.

[11]Damm U, Liu F, Cannon P F, et al. Unraveling legume anthracnose pathogens [J]. Phytopathology, 2013, 103: 33.

[12]陳吳健. 大豆豆莢炭疽病的病原鑒定及其防治[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2007.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

Identification ofColletotrichumchlorophyticausing soybean anthracnose

Li Haiyun, Jin Shuai, Zhang Xueqin, Fan Guanghui, Zhang Jianxin, Xu Yanxia

(JingtangPortOfficeofHebeiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Tangshan063611,China)

The pathogenic fungus isolated from soybean imported from Uruguay was identified asColletotrichumchlorophytibased on the morphological characteristics of the colony and conidia of the fungus, rDNA-ITS and partial sequence of the actin gene, and its pathogenicity to soybean. It was the first report thatColletotrichumchlorophytiwas imported to China.

soybean;Colletotrichumchlorophyti; isolation; identification

2016-03-28

2016-05-13

S 41-30

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.028

致 謝： 本研究得到上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心易建平研究員的悉心指導(dǎo)與大力幫助，特此致謝。

* 通信作者 E-mail:yousliyun@163.com