柳志，陳勇治，舒健，符洋，王俊，呂品，張紅輝，周正

（湖南師范大學第一附屬醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院 肝膽外科，湖南 長沙 410005）

肝內(nèi)膽管癌是高度侵襲性膽管癌家族中一種亞型，來源于膽管上皮細胞，占所有膽管癌的20%～25%[1]，具有高度惡性、高度侵襲性，其3、5年生存率分別為30%、18%[2]。肝內(nèi)膽管結石是肝內(nèi)膽管癌已明確的危險因素[3]，肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌患者由于發(fā)現(xiàn)時往往處于腫瘤晚期，伴有血管神經(jīng)侵犯或轉移，預后很差[4]，因此尋找新的腫瘤生物標志物至關重要，以便早期發(fā)現(xiàn)、早治療、早預防以及預測疾病的進展。膜聯(lián)蛋白A2（annexin A2）是一類鈣依賴磷脂蛋白，與腫瘤細胞的粘連、增殖、凋亡、侵犯、轉移、腫瘤的新生血管生成有密切相關[5]，研究[6]表明上皮-間質(zhì)轉化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是腫瘤細胞具有遷移性和侵襲性的一個主要原因，本研究旨在探討annexin A2與EMT重要生物標志物上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）及波形蛋白（vimentin）[7]在肝內(nèi)膽管結石合并肝內(nèi)膽管癌組織中的表達情況、三者的相關性及臨床意義。

1　材料與方法

1.1　病例資料

收集湖南省人民醫(yī)院病理科2009年1月—2015年8月手術切除的肝內(nèi)膽管組織的蠟塊標本共131例。其中肝內(nèi)膽管結石合并肝內(nèi)膽管癌組織46例（腫瘤組），同期單純肝內(nèi)膽管結石患者膽管炎癥組織標本50例，來自肝血管瘤旁、肝外傷行肝切除術的正常肝內(nèi)膽管組織35例（正常組）。腫瘤組中男24例，女22例；根據(jù)WHO腫瘤分化診斷標準：低分化26例，中分化17例，高分化3例；根據(jù)第7版AJCC/UICC分期方法對ICC進行TNM分期[8]：I～II期15例，III～IV期31例；伴有淋巴結轉移者20例，轉移陰性者26例。所有的病例均得到術后病理證實，排除腫瘤組患者在術前接受過任何放、化療者。

1.2　免疫組化檢測annexin A2、E-cadherin及vimentin的表達

1.2.1主要試劑兔抗annexin A2單克隆抗體（ab41803）、兔抗E-cadherin單克隆抗體（ab15148）、兔抗vimentin單克隆抗體（ab16700）均購自Abcam公司。

1.2.2方法切取石蠟切片，每張切片厚約4 μm，按照免疫組化SP法進行實驗操作，檢測3種因子表達（annexin A2一抗工作濃度為1:500；E-cadherin一抗工作濃度為1:500；vimentin一抗工作濃度為1:500）。以PBS代替一抗作為陰性對照，試劑公司提供的陽性著色圖片為陽性對照。

1.2.3結果判定參考Simons等[9]的評定標準，于光學顯微鏡下觀察染色結果，具體評定標準根據(jù)著色強度和陽性細胞百分比采用半定量法，細胞著色強弱度評分：無著色者0分，淺黃色者1分，棕黃色者2分，棕褐色者3分。陽性細胞數(shù)所占的百分比評分：無陽性細胞者0分，≤10%者1分，11%～50%者2分，51%～75%者3分，≥75%者4分。再根據(jù)上述兩者所得評分相乘結果劃分等級：0～2分為“-”，≥3分即為陽性，其中3～5分為“+”，5～8分為“++”，9～12分則為“+++”。

1.3　統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，不同組別間差異分析采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗，3種因子表達的相關性采用Spearman等級相關分析法，利用Kaplan-Meier法檢測累積生存率并用Graphpad Prism 5繪制生存率曲線，Log-rank比較生存率差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1　免疫組化檢測結果分析

光學顯微鏡下可見膽管細胞annexin A2陽性者染色主要位于細胞膜、細胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色或褐色（圖1）。各組間annexin A2表達率差異統(tǒng)計學意義（P＜0.05）[腫瘤組與炎癥組比較（χ2=10.816，P=0.001）、腫瘤組與正常組比較（χ2=27.208，P＜0.001）、炎癥組與正常對照組比較（χ2=6.480，P=0.011）]，annexin A2的表達強弱關系為：腫瘤組＞炎癥組＞正常組（表1）。光學顯微鏡下可見膽管細胞E-cadherin陽性者染色主要位于細胞膜，呈黃色、棕黃色或褐色（圖2）。各組間E-cadherin表達率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）[腫瘤組與炎癥組比較（χ2=7.223，P=0.007）、腫瘤組與正常組比較（χ2=19.999，P＜0.001）、炎癥組與正常對照組比較（χ2=4.6 2 9，P=0.031）]，E-cadherin的表達強弱關系為：正常組＞炎癥組＞腫瘤組（表1）。光學顯微鏡下可見膽管細胞vimentin陽性者染色主要位于細胞膜、細胞質(zhì)（圖3），呈黃色、棕黃色或褐色。各組間vimentin表達率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）[腫瘤組與炎癥組比較（χ2=6.895，P=0.009）、腫瘤組與正常組比較（χ2=18.415，P＜0.001）、炎癥組與正常對照組比較（χ2=4.857，P=0.028）]；vimentin的表達強弱關系為：腫瘤組＞炎癥組＞正常組（表1）。

圖1　免疫組化檢測annexin A2的表達（×400）　A：正常組；B：炎癥組；C：腫瘤組Figure 1　Immunohistochemical staining for annexin A2 expressions (×400)　A: Normal group; B: In fl ammation group; C: Tumor group

圖2　免疫組化檢測E-cadherin的表達（×400）　A：正常組；B：炎癥組；C：腫瘤組Figure 2　Immunohistochemical staining for E-cadherin expressions (×400)　A: Normal group; B: In fl ammation group; C: Tumor group

圖3　免疫組化檢測vimentin的表達（×400）　A：正常組；B：炎癥組；C：腫瘤組Figure 3　Immunohistochemical staining for vimentin expressions (×400)　A: Normal group; B: In fl ammation group; C: Tumor group

表1　各組3種蛋白表達率的比較[n（%）]Table 1　Comparison of the expressions of the three proteins among the three groups [n (%)]

2.2　膽管癌組織中annexin A2、E-cadherin、vimentin表達的相關性分析

在肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌組織中，相關分析顯示：annexin A2與vimentin的表達呈正相關（r=0.627，P＜0.001）；annexin A2與E-c a d h e r i n的表達呈負相關（r=-0.6 8 2，P＜0.001）；E-cadherin與vimentin的表達呈負相關（r=-0.575，P＜0.001）（表2）。

表2　膽管癌組織中3種蛋白表達的相關性分析（n）Table 2　Correlations among the expressions of the three proteins in cholangiocarcinoma tissues （n）

2.3　annexin A2、E-cadherin、vimentin的表達與膽管癌臨床病理特征的關系

annexin A2、E-cadherin、vimentin的表達均與患者的年齡、性別無關（均P＞0.05）。膽管癌分化程度越低，細胞膜、細胞質(zhì)annexin A2和vimentin表達程度越高，分化越高，其表達程度越低，annexin A2和vimentin的表達與膽管癌的分化程度、淋巴轉移及腫瘤TNM分期有關（均P＜0.05）；對于E-cadherin，腫瘤分化程度越高，細胞膜、細胞質(zhì)內(nèi)E-cadherin表達程度越高，E-cadherin的表達與膽管癌的分化程度、淋巴轉移有關（均P＜0.05），但與腫瘤TNM分期無關（P＞0.05）（表3）。

表3　annexin A2、E-cadherin、vimentin表達與膽管癌患者臨床病理因素的關系[n（%）]Table 3　Relations of the expressions of annexin A2,E-cadherin and vimentin with the clinicopathologic factors of cholangiocarcinoma patients [n (%)]

2.4　肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌患者生存分析

采用電話和患者門診復查的病例資料隨訪腫瘤組患者的生存狀況，隨訪時間終止于2016年9月。術后有5例腫瘤患者未定期到我院復查，電話失去聯(lián)系（病例失訪率10.87%）。肝內(nèi)膽管結石合并膽管癌患者的平均生存時間為25個月，中位生存時間為17個月?；颊咝g后的1、3、5年生存率分別為67.4%、17.4%、4.3%。生存分析顯示，annexin A2表達陽性者的生存率低于其表達陰性者（32 vs.14，χ2=7.845，P=0.0051），vimentin表達陽性者的生存率低于其表達陰性者（25 vs.21，χ2=8.541，P=0.0035），E-cadherin表達陰性者的生存率低于其表達陽性者（36 vs.10，χ2=7.653，P=0.0057）。

根據(jù)本免疫組化實驗結果實際情況，將患者按三種因子的表達情況分為4組：E-cadherin陽性并其余兩種因子均陰性組、E-cadherin陰性并其余兩種因子均陽性組、三種因子均陰性組、annexin A2陽性并其余兩種因子均陰性組（9 vs.24 vs.4 vs.6，其余情況因做生存分析病例數(shù)不足未分組），生存分析顯示：E-cadherin陰性并其余兩種因子均陽性組患者的生存率明顯低于E-cadherin陽性并其余兩種因子均陰性組（χ2=9.7 6 9，P=0.0018），與3種因子均陰性組（χ2=0.8741，P=0.3498）、annexin A2陽性并其余兩種因子均陰性組（χ2=2.717，P=0.0993）比較，無統(tǒng)計學差異；E-cadherin陽性并其余兩種因子均陰性組患者的生存率明顯高于3種因子均陰性組（χ2=6.286，P=0.0122），與annexin A2陽性并其余兩種因子均陰性組無統(tǒng)計學差異（χ2=2.412，P=0.1204）；3種因子均陰性組患者的生存率與annexin A2陽性并其余兩種因子陰性組比較，無統(tǒng)計學差異（χ2=0.04393，P=0.8340）（圖4）。

圖4　不同annexin A2、E-cadherin及vimentin的表達狀態(tài)患者生存率的比較Figure 4　Comparison of survival rates among patients with different sexpressions of annexin A2,E-cadherin and vimentin

3　討　論

膽管癌是高度惡性和高度侵襲性的惡性腫瘤，肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌并不罕見[3]，而我國又是肝膽管結石高發(fā)地[10]，肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生率為5%～13%[11-12]，所以弄清肝內(nèi)膽管結石相關膽管癌的發(fā)病機制十分重要。盡管肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病機制不是十分明確，但慢性增生性膽管炎在癌變過程中至關重要[13]。肝膽管結石患者常伴有膽管炎反復發(fā)展、膽管狹窄、膽汁淤積、慢性細菌感染，這些導致膽管上皮的炎癥遷延不愈及膽管上皮非典型增生，最終可能導致膽管癌的發(fā)生[14]。腫瘤的侵犯和轉移是腫瘤患者死亡的主要原因，Liotta等[15]提出了腫瘤侵襲和轉移的三步曲：粘連、降解及遷移，這有助于理解膽管癌的高度侵襲性及轉移特點。

annexin A2是一種分子量為36 kDa大小的鈣離子依賴的磷脂結合蛋白[16]，其結構高度保守，主要分布在真核細胞的細胞膜、細胞質(zhì)上，一小部分分布在細胞核[17-18]，它參與肌動蛋白細胞骨架動力學調(diào)節(jié)、胞吞作用、胞吐作用、細胞間的粘連、細胞極性及內(nèi)涵體的形成[5]。已有研究[19-20]證明annexin A2參與腫瘤細胞的黏附，通過促進腫瘤細胞DNA的合成、促進原癌基因蛋白的合成、抑制抑癌基因p53介導的細胞凋亡等多種途徑促進腫瘤細胞的增殖[21-22]，促進腫瘤新生血管的形成[23]，能激活纖溶酶原活化系統(tǒng)，通過金屬蛋白酶的活化、降解細胞外基質(zhì)及生長因子的轉換一系列過程從而促進腫瘤細胞遷移、侵犯及轉移[24]，此外annexin A2能通過促進EMT從而促進腫瘤的侵犯和轉移[25]。Yonglitthipagon等[26]發(fā)現(xiàn)annexin A2的高表達與肝吸蟲相關膽管癌高的TNM分期、淋巴結侵犯、轉移及預后不良密切相關，通過Cox多元回歸分析證實annexin A2的表達是肝吸蟲相關膽管癌預后的一個獨立危險因素。本研究發(fā)現(xiàn)，annexin A2在肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌中高表達，在正常組、肝內(nèi)膽管結石炎癥組、腫瘤組，其表達程度依次增高，其陽性表達與肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌的低分化、淋巴結轉移、高的TNM分期密切相關，而且annexin A2表達陽性者較其表達陰性者預后差，提示annexin A2在肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生發(fā)展過程、侵犯及轉移可能起重要作用，同時提示annexin A2可做為肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌的一個潛在的腫瘤生物標志物及預后標志物。

EMT使腫瘤上皮細胞極性喪失，上皮細胞黏附表型轉化到間葉表型，細胞侵襲和遷移能力得到增強，細胞骨架重塑和抑制細胞凋亡，其中應力纖維重排、黏附分子的改變及細胞外基質(zhì)蛋白是腫瘤細胞發(fā)生EMT的關鍵[27]。研究[28-29]表明EMT與膽管癌的侵襲和轉移密切相關。E-cadherin和v i m e n t i n是E M T的兩個標志蛋白[7,30]。E-cadherin是鈣依賴性細胞黏附分子，它是上皮細胞緊密連接系統(tǒng)的主要成分，除了支持細胞間的黏附，E-cadherin能夠影響廣泛的細胞功能，包括細胞信號通路的激活，細胞骨架的調(diào)節(jié)和細胞極性的控制[30]。E-cadherin是EMT的關鍵蛋白[30]，E-cadherin表達缺失是EMT發(fā)生并導致腫瘤侵襲和轉移的標志性變化[31]，E-cadherin表達下調(diào)導致原發(fā)性腫瘤中的腫瘤細胞之間的細胞黏附減弱，因此腫瘤細胞更容易發(fā)生侵潤和轉移[31]。vimentin表達與腫瘤的侵襲和轉移能力成正相關,是間葉細胞表型的常用標志之一[32]。Wei等[32]發(fā)現(xiàn)vimentin可能是通過C-src調(diào)節(jié)E-cadherin/β-catenin復合物來促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。Mao等[33]發(fā)現(xiàn)vimentin的陽性表達與膽管癌的分化程度、靜脈侵犯和肝炎病毒感染相關，通過Cox多元回歸分析證實vimentin的表達是膽管癌預后的一個獨立危險因素。Korita等[34]也發(fā)現(xiàn)vimentin的陽性表達與肝內(nèi)膽管癌的低分化和預后不良相關。Huang等[29]的研究表明E-cadherin的低表達和vimentin的高表達與肝內(nèi)膽管癌的淋巴結轉移和預后差密切相關。本研究再次驗證了以上結論，E-cadherin在肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌中低表達，在正常組、肝內(nèi)膽管結石炎癥組、腫瘤組，E-cadherin表達程度依次降低，與肝內(nèi)膽管癌的分化程度、淋巴結轉移密切相關，盡管本研究結果發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達與肝內(nèi)膽管癌的臨床分期無關（P=0.057），可能與本研究樣本量小有關，但已有許多研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達與膽管癌的臨床分期相關，而且其表達陰性者較其表達陽性者預后差；而vimentin在肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌中高表達，在正常組、肝內(nèi)膽管結石炎癥組、腫瘤組，vimentin表達程度依次增高，與肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌的分化程度、淋巴結轉移、臨床分期密切相關，而且vimentin表達陽性者較其表達陰性者預后差，這些都提示E-cadherin、vimentin 在肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生發(fā)展過程、侵犯及轉移過程可能起重要作用，本研究還發(fā)現(xiàn)：在肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌中，annexin A2與vimentin的表達呈正相關，E-cadherin與annexin A2、vimentin的表達呈負相關，而E-cadherin和vimentin是EMT的兩個標志蛋白，同時生存分析顯示，E-cadherin陰性與annexin A2、vimentin均陽性組患者的生存率明顯低于E-cadherin陽性與annexin A2、vimentin均陰性組（χ2=9.769，P=0.0018），因此推測，annexin A2與EMT之間可能存在某種聯(lián)系通路，這種聯(lián)系通路導致肝內(nèi)膽管結石相關肝內(nèi)膽管癌的侵襲和轉移能力得到明顯增強，從而導致膽管癌患者預后不良。

本研究部分患者未定期復查，對患者術后腫瘤的復發(fā)和轉移情況未掌握準確信息，所有的肝內(nèi)膽管癌患者均行手術治療，肝內(nèi)膽管結石的分布、殘肝有無結石殘留、肝臟切除范圍、淋巴結清掃范圍、患者的體力狀態(tài)等均是影響患者預后的因素，此外，因為樣本量小，未對可能影響預后的因子進行Cox多元回歸分析，故本臨床研究存在一定的局限性。

綜上所述，annexin A2/EMT通路可能參與肝內(nèi)膽管結石相關膽管癌發(fā)生發(fā)展，若能明確通路的具體環(huán)節(jié)及機制，通過阻斷通路的關鍵環(huán)節(jié)從而減弱膽管癌細胞的黏附及遷移能力，為肝內(nèi)膽管結石相關膽管癌的診斷、預防及預后提供重要臨床指導意義。

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