李建宏，李雪萍，張建貴，姚 拓，師尚禮，蔣永梅，馬文文

(甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

飼用玉米根際促生菌資源篩選及其特性研究

李建宏，李雪萍，張建貴，姚 拓，師尚禮，蔣永梅，馬文文

(甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

為獲得玉米根際促生菌(PGPR)菌株并明確其功能特性；以玉米根系及根際土壤為材料，利用選擇性培養(yǎng)基分離篩選溶磷菌與固氮菌，測定所選菌株溶磷能力和固氮酶活性，并測定其產IAA的能力，從中篩選綜合性能優(yōu)良的菌株，在此基礎上，運用生理生化鑒定和16SrDNA分子生物學鑒定相結合的方法鑒定優(yōu)良菌株的種屬。結果表明：玉米根際有大量PGPR菌，分布特征表現(xiàn)出根表(RP)>根表土(RS)>遠根土(NRS)>根內(HP)的數(shù)量分布規(guī)律，呈根際效應。最終獲得262 株PGPR菌，其中固氮菌48 株，溶解無機磷細菌108 株，溶解有機磷細菌106 株，有分泌IAA能力的菌株15株。篩選出綜合性能優(yōu)良、有進一步開發(fā)應用潛力的菌株7株。經鑒定其中3株為Pseudomonasfluorescens；2株為Bacillus subtilis；Klebsiellaoxytoca和Bacillusmegaterium各1株。

玉米；植物根際促生菌；固氮菌；溶無機磷菌；溶有機磷菌；16SrDNA

農牧業(yè)生產中，氮、磷素供應量直接影響作物潛在生產性能和生態(tài)功能的發(fā)揮。為了滿足植物生產所需的氮、磷素等營養(yǎng)物質，化肥一直被認為是解決這一問題的主要(或唯一)途徑。在經濟落后且土壤貧瘠的西部地區(qū)，大量使用高成本的化肥是農牧業(yè)生產成本提高的主要因素之一。同時，隨著化肥施用量的增加，出現(xiàn)了肥效下降、利用率降低等現(xiàn)象，且土壤和植物中NO2-等累積，污染環(huán)境和危及人、畜及食品安全。此外，生產化肥對非再生能源消耗大，破壞土壤結構及微生物多樣性等，引起土壤退化。因此，探尋其他肥料來源以部分替代化肥的作用，實現(xiàn)高效益的循環(huán)農業(yè)已迫在眉睫。

近些年研究表明，植物根際促生菌(簡稱PGPR或促生菌)不但可以固定空氣中的氮氣，同時一些菌還兼具溶解土壤中不能被植物直接利用的磷素，分泌植物生長調節(jié)物質，促進植物根系生長和礦物質吸收，增強抗病性的功能[1]。用從不同環(huán)境、不同植物群落根際分離獲得的特定促生菌株生產的生物菌肥與化肥相比具有成本低、使用安全、持續(xù)效果好、增產穩(wěn)定、非再生能源消耗少、經濟效益高、對環(huán)境和食品無污染等優(yōu)點，同時，還可改善土壤結構、提高土壤有機質含量和改良鹽堿地[2-3]。縱觀世界生物肥料研究與應用現(xiàn)狀，發(fā)達國家(如美國)仍然是世界上研究、生產和使用生物肥料的大國。我國化肥年產量、總產量和單位面積使用量均居世界第一，而微生物肥料年生產量不足化肥的1‰，且品種單一(以豆科植物根瘤菌肥為主)，禾本科植物(除水稻外)及其他非豆科植物專用菌肥的生產幾乎空缺。雖然國外已有規(guī)?；拇偕十a品，但不同生境的植物根際生存著不同的菌株，而不同菌株對環(huán)境的適應性不同。因此，我們只能借鑒國外的成功經驗，從我國特定氣候、植物及生境中不斷地分離篩選高效菌株，以生產出適合我國特定氣候、植物及生境的生物菌肥[4-6]。

玉米具有較高的營養(yǎng)價值，用途廣泛，既可以作為優(yōu)質雜糧食用，也是世界上最受重視的飼料作物之一。在我國糧食和畜牧業(yè)生產中占有重要地位。另一方面，雖然玉米具有極其重要的經濟價值和生態(tài)作用，但其生長過程對氮素和磷素的需求量較大。100年來，化肥一直是提供玉米氮、磷素的主要途徑。然而，隨著化肥使用量的不斷增大，其負面影響日益明顯。

因此，篩選玉米根際PGPR菌，并將其運用于玉米專用生物肥料的研制和生產，不僅對促進我國玉米種植業(yè)發(fā)展具有重要意義，而且對發(fā)展綠色農業(yè)，保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

研究區(qū)位于甘肅省武威市黃羊鎮(zhèn)，2013年8月在采樣區(qū)用五點法獲取玉米根系及根際0～25 cm土壤樣品，存儲于無菌容器，低溫運輸至實驗室立即分離。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 為了研究PGPR菌在植物根際的分布特點，分離時參照文獻[7]的方法，將根際劃分為4個區(qū)域，即遠根土(NRS)、根表土(RS)、根表面(RP)與根內(HP)。

1.2.2 聯(lián)合固氮菌分離純化及固氮特性測定 聯(lián)合固氮菌的分離與純化：在NFM培養(yǎng)基[8-9]表面運用涂布平板法分離純化聯(lián)合固氮菌；固氮菌固氮酶活性的測定：乙炔還原法(ARA)[10]測定固氮酶活性。

1.2.3 溶磷菌的分離純化與溶磷能力測定 溶磷菌的分離純化 溶解無機磷菌株運用平板涂布法在PKO無機磷培養(yǎng)基[7，11]表面分離純化；溶解有機磷菌株運用平板涂布法在蒙金娜有機磷培養(yǎng)基表面分離純化[12]。

溶磷能力測定 溶磷圈法(定性測定，用于菌株初篩)；通過鉬藍比色法定量測定菌株溶磷量，用于菌株復篩[13]。

1.2.4 菌株分泌IAA特性測定 IAA定性測定 spot比色法(用于菌株初篩)[14]；IAA定量測定 高效液相色譜法(用于菌株復篩)[15]。

1.2.5 菌株鑒定 生理生化特征鑒定 將各菌株進行淀粉水解試驗、乙酰甲基甲醇(V-P)試驗、過氧化氫酶試驗、石蕊牛奶試驗、明膠液化試驗、吲哚產生試驗、產硫化氫試驗、糖發(fā)酵試驗、檸檬酸鹽利用試驗、氧化酶試驗、酪朊反應、需VB2試驗、需泛酸鹽試驗等，準確觀察并記錄試驗結果。

16S rRNA分子生物學鑒定 用細菌基因組DNA提取試劑盒(OMEGA，美國)提取各菌株的DNA；用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測分析DNA的純度及濃度；擴增引物為細菌16S rDNA擴增通用引物27F-1492R，序列分別為：27F：5-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3；1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

擴增反應體系為(25 μL)：10×buffer緩沖液2.5 μL，10 mmol/L的Mg2+1.5 μL，25 mmol/L的dNTP 0.5 μL，20 μmol/L的PCR引物各0.5 μL，5 U/μL的TaqDNA聚合酶0.25 μL，約25 ng/μL的模板DNA 2.0 μL，無菌雙蒸水稀釋至25 μL。PCR反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸30 s，重復擴增40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存，然后采用瓊脂糖凝膠電泳法完成擴增產物的檢測。DNA Marker為DL2000(上海生工生物科技公司，中國上海)，將擴增出的產物的測序直接交上海生工生物科技公司完成。以 GenBank中相似度超過 99%的序列的對比序列，運用Clustal X 1.83及Mega 5.3軟件以 N-J鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據處理

數(shù)據整理及制圖采用 Excel 2007，數(shù)據分析采用 SPSS 17.0。

2 結果與分析

2.1 玉米根際促生菌株的分離純化及其數(shù)量分布

利用NFM、PKO和蒙金娜選擇培養(yǎng)基從玉米根際分離出生長速度快、菌落較大的溶解有機磷、無機磷和具固氮能力的菌株，經純化獲得262株，其中固氮菌48株，溶解無機磷108株，有機磷106株。這些菌株在玉米根際的分布特征均表現(xiàn)出根表(RP)>根表土(RS)>遠根土(NRS)>根內(HP)的數(shù)量分布規(guī)律(圖1)，即表現(xiàn)出很強的根際效應。

2.2 玉米根際聯(lián)合固氮菌特性

利用乙炔還原法測定了分離自玉米根際的48 株固氮菌株，其中10 株具有良好的固氮酶活性(表1)，固氮酶活性在2.65～178.94 nmol C2H4/(h·mL)，且各菌株之間固氮酶活性差異較大，大于50 nmol C2H4/(h·mL)的菌株占50%，固氮酶活性最強的5 株菌分別為ZPRW82>ZPRW95>ZPRN45>ZPRS32>ZPRP1，除ZPRS32、ZPRP1之間差異不顯著外，這5株菌的固氮酶活性都顯著高于其他菌株，且均分離自根系表面，生長速度在中等或中等以上。其他菌株固氮酶活性都低于17 nmol C2H4/(h·mL)，其中固氮酶活性相對最低的為分離自玉米遠根土壤中的ZPRN1 菌株，固氮酶活性為2.65 nmol C2H4/(h·mL)，菌株生長速度也較慢。

圖1 固氮菌株與溶磷菌株數(shù)量及分布Fig.1 Sources and distribution of nitrogen fixing and phosphate solubilizing bacteria

表1 菌株固氮酶活性

注：1.同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同；2.+、++、++++代表菌株生長速度，分別為較慢、中等、較快，測量時將菌株在LB培養(yǎng)基于28℃進行純培養(yǎng)，以能生長為明顯的單菌落為準判別生長速度，24 h內的為生長速度較快， 48 h內為中等，72 h內較慢

2.3 玉米根際溶磷菌特性

供試的108株菌株中14 株具有良好的溶解Ca3(PO4)2的能力(PKO 無機磷培養(yǎng)基)，占供試菌株的12.96%，溶磷量為3.10～514.28 μg/mL，以菌株ZPRW63的溶磷量最高，且顯著高于其他13 株；菌株ZPRP32的溶磷量最低。溶解無機磷的菌株的D/d值在1.32～3.80，以ZPRP12的最大，但溶磷量并不是最高，最小的為菌株ZPRP32，且溶磷量ZPRP32也是最低的；溶磷量最高的ZPRW63 的D/d 值卻不是最大的，僅為1.5，菌株ZPRW63 的溶磷量也達到了482.31 μg/mL，但D/d 值也只有2.43。各菌株的PKO 培養(yǎng)液pH在4.04～5.84，均偏酸性，pH 小于5 的菌株溶磷量相對比較高。供試的106 株菌株僅以蛋黃卵磷脂為唯一有機磷源的蒙金娜培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，其中14 株具有良好的溶解有機磷的能力，占供試菌株的13.21%。溶磷量為4.66～39.88 μg/mL，以ZPRM29與ZPRM45 溶磷量最高，且顯著高于其他13株；菌株ZPRM24的溶磷量最低。溶解有機磷的菌株的D/d值在1.12～3.0，以ZPRM49的最大，但溶磷量也不是最高，最小的為菌株ZPRM33，溶磷量為24.21 μg/mL，卻不是最低；溶磷量最高的ZPRM29與ZPRM45的D/d值都為1.63，介于1.12～3.0；各菌株的蒙金娜培養(yǎng)液pH在7.31～7.94，均偏堿性(表2)。

表2 各菌株溶解磷能力

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.4 根際優(yōu)良菌株分泌IAA特性

表3 菌株在King 培養(yǎng)基中分泌IAA 量

注：+，++和+++分別表示淺紅、粉紅、深紅；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

利用顯色法和比色法分別對供試的262株菌株分泌IAA的能力進行了測定，結果表明，15株菌株具有分泌IAA的能力，占供試菌株的5.73%，各菌株的顯色反應與分泌IAA的量成正比關系，即分泌量越大，顏色反應越強烈。各菌株分泌IAA的能力差異顯著，分泌量在1.36～17.80 μg/mL；其中ZPRM45的分泌量最大，ZPRM28的分泌量最??；介于兩者之間相對較好的菌株有6株，分別為ZPRW21、ZPRW18、ZPRP89、ZPRP92、 ZPRM31和ZPRP88(表3)。

2.5 優(yōu)良PGPR菌株的篩選

將2.2，2.3和2.4 所得優(yōu)良菌株按照試驗方法進行交叉測定，結果表明，有7 株菌株具有作為玉米根際促生菌的潛力，其中ZPRW18，ZPRW21和ZPRW82菌株既具有固氮、溶磷能力，又具有分泌IAA 的能力。其他4 種菌株則具有其中2 個能力。綜上，ZPRW18、ZPRW21、ZPRW58、ZPRW61、ZPRW63、ZPRW82、ZPRW95等7 株菌綜合特性優(yōu)良，具有進一步研究開發(fā)的潛力，故作為后期深入研究的供試菌株。

2.6 優(yōu)良菌株鑒定結果

2.6.1 生理生化鑒定 根據表 4生理生化實驗結果，結合菌株革蘭氏染色特性、菌落特征，查閱《伯杰細菌鑒定手冊》[16]以及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]得到ZPRW18，ZPRW58和ZPRW63為假單胞屬，ZPRW21，ZPRW61和ZPRW95為芽孢桿菌屬，ZPRW82暫無法確定(圖2)。

表4 菌株生理生化反應結果

注：表中的符號與《伯杰細菌鑒定手冊(第八版)》和《常見細菌鑒定手冊》保持一致，+表示該反應為陽性，-表示該反應為陰性

圖2 所分離菌株分子系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the isolate strains.

2.6.2 分子生物學鑒定結果 綜合生化實驗結果和分子鑒定結果，發(fā)現(xiàn)研究中所分離的菌株形態(tài)及生化鑒定結果和分子鑒定結果能很好的吻合，說明此次研究的鑒定結果準確可靠，鑒定結果(表5)。

表5 優(yōu)良PGPR菌株鑒定結果

3 討論

國內外的很多研究者在篩選高效溶磷菌株的過程中，以溶磷圈的有無及大小為標準判斷菌株溶磷能力的有無及高低[18-19]。但研究發(fā)現(xiàn)，溶磷圈的大小和溶磷量不完全呈正相關，也有學者發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象[10，20-22]，分析原因是菌株的溶磷機理的復雜性[23]，溶磷圈的出現(xiàn)主要是體現(xiàn)溶磷微生物產酸而造成的，現(xiàn)有研究表明，產酸是微生物溶磷的主要途徑[24]，產生的酸性物質包括葡萄糖酸、2-酮戊二酸、乳酸、草酸、氨基酸、延胡索酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等有機酸[25]和H2S、H2SO4等無機酸[26]，在酸類物質作用下，培養(yǎng)基中Ca3(PO4)2或CaCO3等成分溶解，出現(xiàn)溶磷圈；但除了產酸外，微生物還通過酶解作用和蛋白質作用[27]溶解土壤中的難溶性磷。因此，溶磷圈的大小并不能完全反應溶磷能力的高低，在研究中，以溶磷圈法作為定性測定，鉬銻抗比色法作為定量測定，兩個相結合，來確定菌株的溶磷能力，努力使誤差降低。

在分離、純化具有固氮能力、溶解無機磷和溶解有機磷能力菌株時，發(fā)現(xiàn)各菌株數(shù)量均表現(xiàn)出“根表>根表土>遠根土>根內”的根際分布趨勢，此研究結果與馬文文等[28]，張英[29]，以及趙小蓉等[20-21]的研究結果相一致，由此說明PGPR菌株在土壤中的數(shù)量除了受土壤理化性質、肥力、類型及其耕作措施等因素外，PGPR菌的分布同時也受植物強烈的根際效應的影響。據此可以推測，不同植物根際促生菌的組成必然不同，因此，要開發(fā)效果良好的促生菌產品，就必須從相應環(huán)境中相應植物的根際分離，當然，選育出適應性廣的優(yōu)良菌株也是一個好的研究方向。

除此次研究的溶磷、固氮、分泌生長素等功效外，PGPR另外一個重要的功能就是用于防治農作物病害[30]。用于生防研究的細菌中，熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)是研究報道最多的一種生物防治細菌，它們大量存在于植物根際，繁殖迅速、能分泌嗜鐵素和抗生素，而成為植物位點和空間微環(huán)境的有力競爭者，從而對多種植物病原菌有抑制作用。孫廣正等[30]研究發(fā)現(xiàn)促生菌LHS11對黃瓜枯萎菌(Fusariumoxysporiumsp.cucumerinum)，西瓜尖鐮孢菌(Fusariumoxysporumsp.niveum)抑制效果達80%以上，具有較好的應用潛力。而此次研究也分離出了Pseudomonasfluorescens和Bacillussubtilis，參考前人文獻推測其有拮抗病原菌的潛力，這一方面研究將是下一步工作的重點。

4 結論

玉米根際有大量PGPR菌，分布特征表現(xiàn)出根表(RP)>根表土(RS)>遠根土(NRS)>根內(HP)的數(shù)量分布規(guī)律，最終獲得262 株PGPR菌，其中固氮菌48 株，溶解無機磷108 株，有機磷106 株，有分泌IAA能力的菌株15株。篩選出綜合性能優(yōu)良，有進一步開發(fā)應用潛力的菌株7株，經鑒定其中3株為Pseudomonasfluorescens，2株為Bacillussubtilis，Klebsiellaoxytoca和Bacillusmegaterium各1株；玉米PGPR菌分布呈根際效應，最終篩選出7 株綜合性能良好、有進一步開發(fā)利用價值的PGPR。

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Study on screening and characteristics of PGPR isolated from maize

LI Jian-hong，LI Xue-ping，ZHANG Jian-gui，YAO Tuo，SHI Shang-li，JIANG Yong-mei，MA Wen-wen

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

In order to obtain the plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) from maize and identify the function,the phosphate-solubilization bacteria and nitrogen fixation bacteria were isolated by using rhizosphere soil and selective medium.The potential PGPR strains were screened by measuring the phosphate-solubilization capacity (organic phosphorus and inorganic phosphorus),nitrogen fixation capacity and IAA secretion capacity.And then,the potential strains were identified through physiological and biochemical tests,as well as 16SrDNA sequence analyses.The number of PGPR shown the following order: RP (rhizoplan or root surface) > RS (root soil) > NRS (soil away from roots) > HP (histoplan or root interior).Totally 262 PGPR strains were isolated from the maize rhizosphere,including 48 nitrogen fixing strains,108 inorganic phosphorus-solubilization strains,106 organic phosphorus-solubilization strains and 15 inorganic phosphorus-solubilization strains.In which,7 strains were excellent and had application potential (3 strains werePseudomonasfluorescens,2 strains wereBacillussubtilis,1 strain wasKlebsiellaoxytocaand 1 strain wasBacillusmegaterium).

maize,plant growth promoting rhizobacteria,nitrogen fixing bacteria，inorganic phosphate-solubilizing bacteria，organic phosphate-solubilizing bacteria，16SrDNA

2016-03-14；

2016-04-20

國家自然基金項目(31360584)和農業(yè)部國家牧草產業(yè)技術體系(CARS-35)資助

李建宏(1986-)，男，甘肅臨潭縣人，在讀博士研究生。 E-mail：lijianhong123@126.com 姚拓為通訊作者。

Q 939.96

A

1009-5500(2017)01-0044-07