王 靜，馬寧寧，宋 洋

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

雜環(huán)胺人工抗原的合成以及多克隆抗體的制備

王 靜，馬寧寧，宋 洋*

（天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

為建立適用于一類雜環(huán)胺的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），利用改良的碳化二亞胺法將在2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,4,8-trimethyl-3H-imidazo[4,5-f] quinoxaline，4,8-DiMeIQx）的2-氨基處連接丁二酸單甲酯酰氯制備的半抗原偶聯(lián)蛋白獲得人工抗原。該方法利用適當(dāng)pH值的緩沖體系，將酯的水解和蛋白偶合一步完成，與傳統(tǒng)方法相比，有效地節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間和成本，且對人工抗原的紫外掃描驗(yàn)證和多克隆抗體效價(jià)檢測結(jié)果都直接和間接地表明偶合是成功的。最終免疫獲得4,8-DiMeIQx結(jié)構(gòu)類似物的多克隆抗體，該抗體的最高效價(jià)為1∶450 000，且經(jīng)直接競爭ELISA檢測，該抗體對目標(biāo)物4,8-DiMeIQx的靈敏度（IC50）為24.0 μg/L，最低檢測限（IC15）為1.8 μg/L，對其結(jié)構(gòu)類似物7,8-DiMeIQx、8-MeIQx、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（IQx）、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（TriMeIQx）的靈敏度分別為35.0、30.0、28.0、40.0 μg/L，而其他與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)相差較大的雜環(huán)胺，像2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶（PhIP）、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]喹啉（IQ）和2-氨基-3,4-二氨基咪唑[4,5-f]喹啉（2-amino-3,4-dimethyl-imidazo[4,5-f]quinoline，MeIQ），它們幾乎不與抗體結(jié)合（CR＜0.01%）。由此可見，可以利用該抗體建立高效快速的雜環(huán)胺ELISA檢測方法用以定量或定性檢測肉類加工食品中的一類雜環(huán)胺。

雜環(huán)胺；半抗原；人工抗原；多克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附檢測方法

一些流行病學(xué)的研究已經(jīng)證實(shí)，雜環(huán)胺可能是人類致癌物[1]。而在普遍使用高溫烹飪的即食食品和加工食品中，會(huì)生成大量的雜環(huán)胺。根據(jù)食物熱處理溫度的不同，雜環(huán)胺可進(jìn)一步分為氨基咪唑氮雜芳烴（aminoimidazo azaarenes，AIAs）和氨基咔啉[2]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將一些AIAs視為可能的人類致癌物，如2-氨基-3,4-二氨基咪唑[4,5-f]喹啉（2-amino-3,4-dimethyl-imidazo[4,5-f]quinoline，MeIQ）、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,4,8-trimethyl-3H-imidazo[4,5-f]quinoxaline，4,8-DiMeIQx）、2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3-methyl-3H-imidazo[4,5-f] quinoxaline，IQx）、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,7,8-trimethyl-imidazo[4,5-f]quinoline，7,8-DiMeIQx）和2-氨基-3-甲基咪唑[4,5-f]喹啉（2-amino-3-methyl-imidazo[4,5-f]quinoline，IQ）[3]。

國內(nèi)外關(guān)于雜環(huán)胺的定量和定性方面的研究很多。近年來，常用的雜環(huán)胺檢測方法是高效液相色譜法[4-6]，或者是一些檢測效果更好的儀器串聯(lián)技術(shù)如串聯(lián)式固相萃取-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)[7-9]。而且只要是那些利用同步熒光法，再結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的分析方法，比如氣相色譜分析、質(zhì)譜分析和超高效液相色譜分析[10-12]，都可以高效地定量烤肉樣品中的雜環(huán)胺。目前，為了消除基質(zhì)效應(yīng)（脂肪、蛋白質(zhì)、糖、色素等）所運(yùn)用的樣品前處理方法有液液萃取[13-14]、超臨界流體萃取[15]、固相萃取[16-17]、柱層析[18-19]、固相微萃取[20]以及液液萃取-固相萃取串聯(lián)萃取法。這些檢測方法雖然靈敏度好、準(zhǔn)確度高，但還存在很多問題，如前處理復(fù)雜、儀器成本高、自動(dòng)化程度低，因此，需要熟練的技術(shù)型人才，且步驟多耗時(shí)，不適合運(yùn)用于大量樣本的監(jiān)測。

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是基于免疫學(xué)原理的一種簡便、快速的新型小分子殘留檢測方法。雖然，ELISA法的準(zhǔn)確性略低于傳統(tǒng)儀器法，但是通過ELISA法的初步篩選可以大大減少樣本的數(shù)量，從而減少后續(xù)儀器分析的工作量。在20世紀(jì)90年代早期，Vanderlaan等[21-22]就建立了一種ELISA方法用于檢測樣品中IQ、MeIQ、4,8-DiMeIQx、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine，PhIP）的含量，但是由于雜環(huán)胺之間的交叉反應(yīng)以及干擾物質(zhì)的存在使得高效地量化樣品中各雜環(huán)胺的難度很大，尤其是復(fù)雜的樣品。因此，這些年來關(guān)于雜環(huán)胺免疫學(xué)檢測方法的研究幾乎沒有。主要的原因是：首先，合成半抗原的原料昂貴；其次，盡管雜環(huán)胺的熱穩(wěn)定性高，但其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使得在反應(yīng)過程中產(chǎn)生更多的副產(chǎn)物，不利于獲得較純的半抗原。最重要的是，由于在復(fù)雜樣品基質(zhì)中雜環(huán)胺的含量很低，因此，制備一種高靈敏性和特異性地抗體對于建立雜環(huán)胺ELISA檢測方法是至關(guān)重要的。

本實(shí)驗(yàn)為了建立適用于一類雜環(huán)胺的ELISA檢測方法，通過在4,8-DiMeIQx的2-氨基處連接4個(gè)碳的間隔臂制備半抗原，然后使用改進(jìn)的碳化二亞胺法，同時(shí)進(jìn)行兩步反應(yīng)，即間隔臂末端的酯水解反應(yīng)和其反應(yīng)產(chǎn)物與蛋白偶聯(lián)反應(yīng)，這樣有效地減少了反應(yīng)步驟和副產(chǎn)物的生成。這種新的制備人工抗原的方法簡單高效地獲得了高特異性的多克隆抗體，為建立快速檢測肉類加工產(chǎn)品中雜環(huán)胺含量的ELISA方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4,8-DiMeIQx、IQx、7,8-DiMeIQx、MeIQ、IQ、2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,8-dimethyl-imidazo[4,5-f]quinoxaline，8-MeIQx）、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉（2-amino-3,4,7,8-tetramethyl-imidazo[4,5-f]quinoxaline，TriMeIQx）、PhIP加拿大TRC公司；丁二酸單甲酯酰氯（methyl 4-chloro-4-oxobutyrate，MCO）、卵清蛋白（ovabulmin，OVA）、N,N-二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）、弗氏完全佐劑和不完全佐劑、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidine，TMB）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-[3-dimethylamino propyl]carbodiim-ide hydrochloride，EDC）、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP） 美國Sigma-Aldrich公司；羊抗兔酶標(biāo)二抗 中美生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA） 德國Merck公司；蛋白A親和層析柱美國GE公司。

1.2 儀器與設(shè)備

旋蒸儀 中國予華儀器公司；AV-300MHZ核磁共振儀 德國Bruker公司；LCQ Advantage液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo Finnegan公司；Labsystems全波長酶標(biāo)儀 美國雷勃公司；?KTA?蛋白純化儀 美國GE公司；RH-KT加熱磁力攪拌器 美國IKA公司；低溫恒溫培養(yǎng)箱 上海Eyela公司；Lambda 35紫外分光光度儀美國Perkin Elmer公司；96 孔酶標(biāo)板 丹麥Nunc公司。

1.3 方法

1.3.1 常用的緩沖溶液

0.0 1 m o l/L的磷酸鹽緩沖液（p H 7.4，phosphate buffered saline，PBS）；PBST緩沖液（1 L PBS+0.5 g吐溫-20）；130 mmol/L的NaHCO3溶液（pH 8.1）。

1.3.2 半抗原及人工抗原的合成

1.3.2.1 PA的合成

用1 0 0 m L的無水二氯甲烷溶解2 0.0 m g的4,8-DiMeIQx（0.088 mmol），水浴降溫至0 ℃，再在不斷攪拌的溶液中緩慢滴加含有 11 μL MCO（1.223 g/mL）的30 mL的無水二氯甲烷，反應(yīng)混合物在0 ℃攪拌反應(yīng)3 h后轉(zhuǎn)至室溫過夜反應(yīng)，并由薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）監(jiān)測。以上反應(yīng)均在N2環(huán)境下進(jìn)行，反應(yīng)終止后，用20 mL飽和碳酸氫鈉溶液沖洗3 次去除氫離子，有機(jī)相經(jīng)無水Na2SO4干燥，過濾，旋蒸儀（45 ℃）減壓旋干濾液。殘?jiān)M(jìn)一步經(jīng)硅膠柱純化，且洗脫條件以及洗脫液的選擇（二氯甲烷-無水甲醇（60∶1，V/V））由TLC結(jié)果確定，最后獲得產(chǎn)物（PA）為深紅色粉末狀，產(chǎn)率為60%。圖1為PA的合成過程。

圖1 PA的合成Fig.1 Synthesis process of hapten

1.3.2.2 酯的水解

稱取10.0 mg PA（0.03 mmol）溶解于700 μL無水DMF中，再加入4.0 mL無水甲醇和2.0 mL去離子水?dāng)嚢杌旌?。然后向溶液中逐滴加?0 μL氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L），室溫?cái)嚢? h，然后加入20.0 mL去離子水，靜置10 min，用1.0 mol/L的稀鹽酸溶液將反應(yīng)溶液調(diào)成微酸，然后用10 mL乙酸乙酯萃取3 次，有機(jī)相再經(jīng)10 mL去離子水沖洗3 次后通過無水Na2SO4干燥，減壓旋干獲得產(chǎn)物PB，TLC（石油醚-乙酸乙酯（10∶1，V/V）+ 1%醋酸）監(jiān)測反應(yīng)，PB（Rf=0.40）產(chǎn)率15%。質(zhì)譜檢測產(chǎn)物PB，結(jié)果顯示：在負(fù)離子模式圖中，基峰的質(zhì)荷比為339.10，而相對強(qiáng)度為80%的峰的質(zhì)荷比為325.20，與產(chǎn)物PB（C16H17N5O3）的理論分子質(zhì)量一致。

1.3.2.3 酯的胺解作用

參照Davis等[23]使用的碳化二亞胺法，利用產(chǎn)物PA間隔臂的末端酯的胺解作用偶聯(lián)載體蛋白制備人工抗原。A液：稱取0.19 μmol的BSA（或OVA、HRP）溶解在2 mL的碳酸氫鈉溶液（130 mmol/L，pH 8.1）中；B液：稱取3.75 μmol PA和7.5 μmol EDC溶于0.1 mL的DMF中。將B液緩慢加入A液中（0 ℃以下），室溫?cái)嚢?～6 h后，加入3.75 μmol EDC，4 ℃反應(yīng)過夜。最后，反應(yīng)溶液在4 ℃用PBS透析3 d，加入0.1%的疊氮化鈉或等體積的甘油，-20 ℃貯存。其中，PA-BSA和PA-KLH作為免疫原，PA-OVA作為包被原，且經(jīng)紫外掃描初步確定偶聯(lián)是否成功。

1.3.3 多克隆抗體的制備

免疫動(dòng)物選擇日本大白兔（月齡3 個(gè)月，體質(zhì)量1.5 kg，天津生物醫(yī)學(xué)工程研究所養(yǎng)殖場）經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射免疫原，免疫方法與過程參考Wang Suo等[24]的研究。選取2 只符合條件的兔子，每次每只兔子的免疫劑量為1 mg（免疫原含量），隔兩周免疫1次，從第2次免疫開始，每次免疫1 周后，從耳背動(dòng)脈采血，測定抗血清效價(jià)，直至效價(jià)達(dá)到較高水平時(shí)處死兔子，取全血。血液先室溫條件下凝固15 min，然后3 500 r/min離心10 min，取上清即抗血清，加0.1%的疊氮化鈉，4 ℃貯存。用Protein A-Sepharose 4B純化抗血清，洗脫液經(jīng)PBS透析72 h，加0.1%疊氮化鈉貯存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 抗體特異性

利用直接ELISA法，以標(biāo)品的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)繪制抑制曲線。抑制率計(jì)算如式（1）所示：

式中：A0為標(biāo)品質(zhì)量濃度為零時(shí)的吸光度；Ax為標(biāo)品質(zhì)量濃度為x時(shí)的吸光度；A空白為空白孔的吸光度。

Kurtz等[25]認(rèn)為抗體的效價(jià)和其特異性直接相關(guān)，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并非如此。事實(shí)上，可以通過比較它與其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)來判斷其特異性。交叉反應(yīng)率（cross reactivity，CR）越小，說明該抗體對目標(biāo)物的特異性越高，而如果該抗體與其他該類結(jié)構(gòu)類似物也有較高的CR，那么該抗體就可用于這類目標(biāo)物的檢測。CR計(jì)算如式（2）所示：

式中：IC50為標(biāo)品的抑制率為50%時(shí)所對應(yīng)的標(biāo)品質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的制備

目標(biāo)物4,8-DiMeIQx與小分子物質(zhì)丁二酸單甲酯酰氯發(fā)生取代反應(yīng)，脫去一分子HCl，生成粗產(chǎn)物PA，反應(yīng)過程如圖1所示。反應(yīng)經(jīng)TLC（展開劑：二氯甲烷-無水甲醇（60∶1，V/V））監(jiān)測，當(dāng)反應(yīng)過夜后，發(fā)現(xiàn)原料4,8-DiMeIQx點(diǎn)（Rf=0）和丁二酸單甲酯酰氯（Rf =0.20）幾乎消失，且出現(xiàn)了新的點(diǎn)（Rf =0.37），初步斷定反應(yīng)完成，最后經(jīng)硅膠柱純化后獲得產(chǎn)物PA，通過質(zhì)譜及核磁檢測，可以證明PA就是實(shí)驗(yàn)的理論產(chǎn)物。該方法只有一步取代反應(yīng)，操作簡單，無副產(chǎn)物，且產(chǎn)率高。產(chǎn)物PA的TLC結(jié)果：TLC（二氯甲烷-無水甲醇（60∶1，V/V），Rf=0.37；質(zhì)譜結(jié)果顯示：在正離子模式圖中，基峰的質(zhì)荷比為342.36，與產(chǎn)物PA（C17H19N5O3）的理論分子質(zhì)量一致。核磁結(jié)果：1H NMR（400 MHz, CDCl3）：δ 10.30（1H, s, NH），δ 8.68（1H, s, N-CH-C），δ 7.81（1H, d, phH），δ 3.61（3H, s, COOCH3），δ 3.47（1H, s, N-CH3），δ 2.54～2.49（4H, m, CH2），δ 2.42（1H, s, CH3），δ 1.92（1H, s, CH3）。

2.2 酯的水解及蛋白偶聯(lián)

一般情況下，半抗原的末端羧基和載體蛋白的氨基反應(yīng)生成人工抗原。因此，產(chǎn)物PA需要經(jīng)過一步脂水解反應(yīng)，從而暴露其羧基端。但是，酯水解反應(yīng)結(jié)果不太理想。一方面，在水解過程中，由于PA的酰胺鍵很容易斷開，所以一些反應(yīng)條件，如pH值、反應(yīng)時(shí)間和溫度必須進(jìn)行優(yōu)化；另一方面，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)TLC、質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)有很多副產(chǎn)物生成，目標(biāo)產(chǎn)物則合成轉(zhuǎn)化率低（只有15%）。而優(yōu)化水解條件和凈化產(chǎn)物都需消耗太多的原料。

圖2 PA、BSA和PA-BSA的紫外掃描圖Fig.2 Ultraviolet (UV) absorption spectra of PA, BSA and PA-BSA

圖3 PA、OVA和PA-OVA的紫外掃描圖Fig.3 UV Absorption spectra of PA, OVA and PA-OVA

圖4 PA、HRP和PA-HRP的紫外掃描圖Fig.4 UV Absorption spectra of PA, HRP and PA-HRP

因此，最后使用改進(jìn)的EDC法，在弱堿條件下，通過酯的胺解作用使酯水解反應(yīng)與蛋白偶聯(lián)反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，有效地減少原料的損耗和副產(chǎn)物的生成。從圖2～4可以看出，半抗原PA在波長270.12 nm有一個(gè)較高的紫外吸收峰，如果半抗原和載體蛋白偶聯(lián)成功，則人工抗原在280 nm處的紫外吸收峰會(huì)在半抗原影響下，向左側(cè)偏移，而實(shí)際確實(shí)如此，雖然偏移較小，這可能是因?yàn)榕悸?lián)比較小，而在此后獲得高效價(jià)的抗體也充分證明人工抗原的成功合成。

2.3 抗體的效價(jià)

圖5 在免疫期間抗體效價(jià)的變化Fig.5 Change in antiserum titer during immunization

用間接ELISA法測定抗體的效價(jià)，包被量為1 μg/well，酶標(biāo)二抗稀釋5 000 倍。用酶標(biāo)儀讀取A450nm值，選擇吸光度約為1.0時(shí)的抗體稀釋倍數(shù)作為多克隆抗體的效價(jià)。由圖5可以看出，隨著免疫次數(shù)的增加，抗體效價(jià)也逐漸升高，且該免疫原產(chǎn)生了高效價(jià)的抗體，但因?yàn)橥米娱g的生理差異，兔1和兔2的效價(jià)略有不同，其最高的抗體效價(jià)分別為1∶450 000和1∶440 000。而且從ELISA結(jié)果可以看出，所有抗體的稀釋倍數(shù)與其吸光度呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果與理論一致。

2.4 直接競爭ELISA法的建立

采用直接ELISA法優(yōu)化酶標(biāo)抗原的最適質(zhì)量濃度，將酶標(biāo)抗原進(jìn)行一系列的梯度稀釋，選擇吸光度在0.7～1.2之間的酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)，最后得出最佳酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為180 000。以上述酶標(biāo)抗原優(yōu)化抗體包被量，如圖6所示，PA-BSA1的抗體（兔1）和PA-BSA2的抗體（兔2）與酶標(biāo)抗原PA-HRP都有較好的親和性，但當(dāng)包被抗體PA-BSA2，且包被量為0.5 μg/well時(shí)，IC50值最低，因此，選擇抗體PA-BSA2進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖6 抗體包被量的優(yōu)化Fig.6 Optimization of coating antibody concentration

不同的化學(xué)條件包括離子濃度、pH值和有機(jī)溶劑含量也需進(jìn)行優(yōu)化。一方面，雜環(huán)胺耐酸堿，但需考慮其對抗體及酶活性的影響；另一方面，隨著離子濃度的增大，抗體和目標(biāo)物的親和性逐漸下降，說明離子濃度較高時(shí)，不利于抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，所以最終選擇pH值為7.4，離子濃度為10 mmol/L的PBS。當(dāng)甲醇含量大于5%時(shí)，檢測靈敏度明顯降低，所以標(biāo)品溶液的甲醇含量要低于5%。根據(jù)以上優(yōu)化的反應(yīng)條件，建立直接競爭ELISA法，得出目標(biāo)物4,8-DiMeIQx的抑制曲線如圖7所示，且目標(biāo)物的靈敏度（IC50）和檢測限（IC15）分別是24.0 μg/L和1.8 μg/L。

圖7 4,8-DiMeIQx的抑制曲線Fig.7 Inhibitory curve of 4,8-DiMeIQx

2.5 抗體特異性

通過優(yōu)化的直接ELISA法研究了7 種雜環(huán)胺的抗體結(jié)合反應(yīng)即交叉反應(yīng)。結(jié)果顯示（表1）：對于那些結(jié)構(gòu)與目標(biāo)物非常接近的雜環(huán)胺與抗體有較高親和性，如7,8-DiMeIQx、8-MeIQx、IQx和TriMeIQx與抗體的CR分別為68.6%、80%、85.7%和60%。而其他含有與目標(biāo)物雜環(huán)結(jié)構(gòu)不同的雜環(huán)胺，像PhIP、IQ和MeIQ，它們幾乎不與抗體結(jié)合（CR＜0.01%）。由此說明，目標(biāo)物的空間結(jié)構(gòu)很大地影響了抗原與抗體的反應(yīng)；該抗體可以高特異性地識別目標(biāo)物及與其結(jié)構(gòu)相似的一些雜環(huán)胺，為建立這些雜環(huán)胺的免疫學(xué)檢測方法提供了可能。

表1 抗體與4,8-DiMeIQx及其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)Table1 Cross-reactivity of antiserum against 4,8-DiMeIQx with other analogues

3 結(jié) 論

本研究首先利用MCO延長了4,8-DiMeIQx的間隔臂生成產(chǎn)物PA，然后通過酯水解反應(yīng)暴露出PA的末端羧基得到產(chǎn)物PB，但由于產(chǎn)物PA中酰胺鍵的存在，使得該反應(yīng)副產(chǎn)物較多，且PB產(chǎn)率低，考慮到優(yōu)化反應(yīng)條件及提高產(chǎn)率所消耗的時(shí)間和成本，最后決定利用酯的胺解作用，通過改進(jìn)的EDC法將產(chǎn)物PA直接偶聯(lián)載體蛋白制備人工抗原，并獲得了高效價(jià)的多克隆抗體。然后，經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)條件建立了4,8-DiMeIQx的直接競爭ELISA法，得到目標(biāo)物的檢測限（IC15）和靈敏度（IC50）分別是1.8 μg/L和24.0 μg/L，證明了抗體的靈密度高；而交叉反應(yīng)結(jié)果則表明，雖然該抗體對目標(biāo)物4,8-DiMeIQx的特異性較低，但是可以有效地識別一類結(jié)構(gòu)相似的雜環(huán)胺，且這些雜環(huán)胺經(jīng)IARC認(rèn)定為可能的人類致癌物，所以需要為其建立有效、靈敏的免疫學(xué)檢測方法用以監(jiān)測肉類加工食品。

利用該多克隆抗體，再結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)室的研究成果，可以建立新的雜環(huán)胺免疫檢測方法，如ELISA法、SPR法等，從而能快速高效地檢測加工食品中一類雜環(huán)胺的含量。更重要的是，與傳統(tǒng)分析方法相比，對于環(huán)境污染的研究和監(jiān)測，這些相對簡單、靈敏和高特異性的免疫學(xué)分析方法可以發(fā)揮更重要的作用。

[1] RAHMAN U U, SHAHZAD T, SAHAR A, et al. Recapitulating the competence of novel & rapid monitoring tools for microbial documentation in food systems[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 67: 62-69. DOI:10.1016/j.lwt.2015.11.041.

[2] J?GERSTAD M, SKOG K, ARVIDSSON P, et al. Chemistry, formation and occurrence of genotoxic heterocyclic amines identif i ed in model systems and cooked foods[J]. European Food Research and Technology, 1998, 207(6): 419-427. DOI:10.1007/s002170050355.

[3] DURLING L. The effect on chromosomal stability of some dietary constituents[D]. Sweden: Uppsala University, 2008.

[4] URSZULA B, BEATA J. Analysis of azaarenes in pan fried meat and its gravy by liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Food Chemistry, 2008, 109(1): 235-242. DOI:10.1016/ j.foodchem.2007.12.038.

[5] BARCELO-BARRACHINA E, MOYANO E, PUIGNON L, et al. Evaluation of different liquid chromatography-electrospray mass spectrometry systems for the analysis of heterocyclic amines[J]. Journal of Chromatography A, 2004, 1023: 67-78. DOI:10.1016/ j.chroma.2003.10.030.

[6] YAO Yao, PENG Zengqi, SHAO Bin, et al. Effects of the antioxidant capacities of 20 spices commonly consumed on the formation of heterocyclic amines in braised sauce beef[J]. China Agriculture Science, 2012, 45(20): 4252-4259. DOI:10.3864/ j.issn.0578-1752.2012.20.015.

[7] BARCELO-BARRACHINA E, MOYANO E, GALCERAN M T, et al. Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of heterocyclic amines in food[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1125(2): 195-203. DOI:10.1201/b16670-8.

[8] KATAOKA H, ISHIZAKI A, NONAKA Y, et al. Developments and applications of capillary microextraction techniques: a review[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 655(1/2): 8-29. DOI:10.1016/ j.aca.2009.09.032.

[9] KATAOKA H, SAITO K. Recent advances in column switching sample preparation in bioanalysis[J]. Bioanalysis, 2012, 4(7): 809-832. DOI:10.4155/bio.12.28.

[10] KHAN M R, BUSQUETS R, SANTOS F J, et al. New method for the analysis of heterocyclic amines in meat extracts using pressurised liquid extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1194(2): 155-160. DOI:10.1016/j.chroma.2008.04.058.

[11] SAHAR A, PORTANGUEN S, KONDJOYAN A, et al. Potential of synchronous fluorescence spectroscopy coupled with chemometrics to determine the heterocyclic aromatic amines in grilled meat[J]. European Food Research and Technology, 2010, 231(5): 803-812. DOI:10.1007/s00217-010-1323-6.

[12] FERNANDO D A, MOHAMMED Z, GREGORIO C, et al. Determination of heterocyclic amines in urine samples by capillary liquid chromatography with evaporated light-scattering detection[J]. Analytical Biochemistry, 2010, 397(1): 223-231. DOI:10.1007/ s00216-009-3370-z.

[13] KOBAYASHI M, HANAOKA T, TSUGANE S. Validity of a self-administered food frequency questionnaire in the assessment of heterocyclic amine intake using 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP) levels in hair[J]. Mutation Research, 2007, 630(1/2): 14-19. DOI:10.1016/ j.mrgentox.2007.02.003.

[14] MARTíN-CALERO A, AYALA J H, GONZáLEZ V, et al. Determination of less polar heterocyclic amines in meat extracts: Fast sample preparation method using solid-phase microextraction prior to high-performance liquid chromatography-fluorescence quantification[J]. Analvtica Chimica Acta, 2007, 582(2): 259-266. DOI:10.1016/j.jchromb.2003.09.028.

[15] FERNANDO D A, MOHAMMED Z, GREGORIO C, et al. Simultaneous determination of six non-polar heterocyclic amines in meat samples by supercritical fl uid extraction-capillary electrophoresis under fl uorimetric detection[J]. Electrophoresis, 2010, 31(13): 2165-2173. DOI:10.1002/elps.201000080.

[16] BESSETTE E E, YASA I, DUNBAR D, et al. Biomonitoring of carcinogenic heterocyclic aromatic amines in hair: a validation study[J]. Chemical Research in Toxicology, 2009, 22(8): 1454-1463. DOI:10.1021/tx900155f.

[17] GU D, NEUMAN Z L, MODIANO J F, et al. Biomonitoring the cooked meat carcinogen 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b] pyridine in canine fur[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(36): 9371-9375. DOI:10.1021/jf302969h.

[18] GROSS G A. Simple methods for quantifying mutagenic heterocyclic aromatic amines in food products[J]. Carcinogenesis, 1990, 11: 1597-1603. DOI:10.1093/carcin/11.9.1597.

[19] OHGAKI H, TAKAYAMA S, SUGIMURA T. Carcinogenicities of heterocyclic amines in cooked food[J]. Mutation Research, 1991, 259: 399-410. DOI:10.1016/0165-1218(91)90130-e.

[20] KATAOKA H, INOUE T, SAITO K, et al. Analysis of heterocyclic amines in hair by on-line in-tube solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2013, 786: 54-60. DOI:10.1016/ j.aca.2013.05.007.

[21] VANDERLAAN M, HWANG M, KNIZE M G, et al. Monoclonal antibody based immunoassays for cooking-induced meat mutagens[J]. Progress in Clinical and Biological Research, 1990, 340E: 189-198. DOI:10.1093/carcin/bgh350.

[22] VANDERLAAN M, ALEXANDER J, THOMAS C, et al. Immunochemical detection of rodent hepatic and urinary metabolites of cooking-induced food mutagens[J]. Carcinogenesis, 1991, 12(2): 349-354. DOI:10.1093/carcin/12.2.349.

[23] DAVIS M T, PRESTON J F. A simple modified carbodiimide method for conjugation of small-molecular-weight compounds to immunoglobulin G with minimal protein crosslinking[J]. Analytical Biochemistry, 1981, 116(2): 402-407. DOI:10.1016/0003-2697(81)90380-8.

[24] WANG Suo, ALLAN R D, SKERRITT J H, et al. Development of a class-specific competitive ELISA for the benzoylphenylurea insecticides[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(8): 3330-3338. DOI:10.1021/jf9800920.

[25] KURTZ D A, SKERRITT J H, STANKER L. New frontiers in agrochemical immunoassay[M]. AOAC International, 1995: 9.

Preparation of Artif i cial Antigen and Polyclonal Antibody for the Detection of Heterocyclic Amines

WANG Jing, MA Ningning, SONG Yang*
(Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)

With the aim of developing a generic enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of heterocyclic amines, a new approach was used to prepare hapten, in which, methyl 4-chloro-4-oxobutyrate (MCO) was attached to the 2-amino group of 2-amino-3,4,8-trimethyl-3H-imidazo[4,5-f]quinoxaline (4,8-DiMeIQx). The antigen was obtained by a modif i ed carbodiimide method. In pH buffer system at the appropriate pH, the hydrolysis of ester and the coupling step were completed simultaneously. Compared with the traditional method, the new method shortened the reaction time and cut down the cost effectively. The results of UV identif i cation and polyclonal antibody titer indicated that the coupling was successfully achieved. And the immunogens produced polyclonal antibody for 4,8-DiMeIQx with a high titer of 1:450 000. High-affinity antibody against 4,8-DiMeIQx was optimized and a direct competitive ELISA assay was developed. It was shown that the analyte concentration giving 50% inhibition of color development (IC50) was 24.0 μg/L and that giving 15% inhibition of color development (IC15) was 1.8 μg/L for 4,8-DiMeIQx, and IC50was 35.0 μg/L for 7,8-DiMeIQx, 30.0 μg/L for 8-MeIQx, 28.0 μg/L for IQx, and 40.0 μg/L for TriMeIQx, respectively, while almost no cross-reactivity (CR ＜ 0.01%) with other heterocyclic amines having a structure different from that of 4,8-DiMeIQx, such as PhIP, IQ and MeIQ, was observed. The developed ELISA method was suitable for the rapid quantitative and qualitative determination of heterocyclic amines in processed meat products.

heterocyclic aromatic amines; hapten; antigen; polyclonal antibody; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

10.7506/spkx1002-6630-201704008

R155

A

1002-6630（2017）04-0045-06

2016-03-29

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD04B03）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301487）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（142CDGNC00098）

王靜（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測。E-mail：1576901938@qq.com

*通信作者：宋洋（1983—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測。E-mail：skysongy@mail.tjnu.edu.cn

王靜, 馬寧寧, 宋洋. 雜環(huán)胺人工抗原的合成以及多克隆抗體的制備[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 45-50. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201704008. http://www.spkx.net.cn

WANG Jing, MA Ningning, SONG Yang. Preparation of artificial antigen and polyclonal antibody for the detection of heterocyclic amines[J]. Food Science, 2017, 38(4): 45-50. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704008. http://www.spkx.net.cn