程清萍 柯耀棋

NSCLC外周血Runx3基因啟動子甲基化臨床意義

程清萍 柯耀棋

目的 研究非小細胞肺癌(None-small cell lung cancer，NSCLC)患者外周血Runx3基因啟動子甲基化的臨床意義。方法 選擇NSCLC患者(NSCLC組)和正常健康人(CON組)為研究對象，檢測并比較兩組研究對象外周血Runx3基因啟動子甲基化，比較外周血Runx3基因啟動子甲基化與未甲基化患者R0切除率、3年生存率及總生存時間的差異。結果 NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動子甲基化率顯著高于CON組(P<0.05)。NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動子甲基化在胸腔積液、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期存在明顯差異(均P<0.05)。NSCLC組患者Runx3基因啟動子甲基化者R0切除率、3年生存率及總生存時間均顯著低于未甲基化者(均P<0.05)。結論 NSCLC患者外周血Runx3基因啟動子甲基化異常，在病情及預后評估中具有一定臨床價值。

NSCLC；Runx3；啟動子；甲基化；臨床意義

非小細胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病機制與基因啟動子甲基化異常密切相關，國內(nèi)外研究證實甲基化異常在NSCLC病情及預后評估中具有重要意義，可作為其病情及預后評估的標志物[1-2]。Runx3基因可調(diào)控TGF-β信號傳導通路而調(diào)控細胞周期，基因啟動子甲基化已被證實與NSCLC病情及預后密切相關，可作為NSCLC病情及預后評估的標志物，但這些研究多為術后病理標本的檢測，存在極大的臨床限制[3-4]。本研究檢測NSCLC患者外周血Runx3基因啟動子甲基化，研究其在NSCLC病情及預后評估中的臨床價值。

資料與方法

一、研究對象

選擇2011年1月至2013年1月診治的NSCLC患者為研究對象(NSCLC組)，均符合以下標準：① 經(jīng)癥狀體征、腫瘤標志物、肺部增強CT和病理組織學檢查確診；② 原發(fā)腫瘤發(fā)生于單側(cè)肺，既往未行手術、放療、化療及靶向藥物等治療；③ KPS評分≥70分，預計生存期超過3個月；④ 排除既往肺癌復發(fā)，排除合并其他腫瘤及嚴重心腦肺疾病。另選擇同期體檢的正常健康人為對照(CON組)，NSCLC組和CON組研究對象在性別、年齡、KPS評分方面的差異均無統(tǒng)計學意義，均P>0.05，(見表1)。

表1 NSCLC組和CON組研究對象一般臨床資料比較

二、Runx3基因啟動子甲基化檢測

NSCLC組和CON組研究對象均空腹8h后取靜脈血，提取基因組gDNA純化，采用甲基化特異性PCR法檢測兩組研究對象外周血Runx3基因啟動子甲基化，引物采用Methyl Primer Express V1.0設計，具體序列(見表2)。反應體系為25μL，反應條件為：95℃預變性10min，95℃變性60s，61℃退火45，72℃延伸45s，共32個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸8min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后根據(jù)條帶顯示結果判斷甲基化(M)和未甲基化(U)。

表2 甲基化特異性PCR檢測Runx3基因啟動子甲基化引物序列

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS12.0進行統(tǒng)計學分析。NSCLC患者Runx3基因啟動子甲基化率在不同臨床病理因素中差異采用χ2檢驗。NSCLC組患者Runx3基因啟動子甲基化和未甲基化預后對比采用t或χ2檢驗。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、Runx3基因啟動子甲基化比較

NSCLC組外周血Runx3基因啟動子甲基化50例，甲基化率為71.4%，CON組正常健康人Runx3基因啟動子甲基化1例，甲基化率為2.0%，NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動子甲基化率顯著高于CON組正常健康人(P<0.05)。

二、Runx3基因啟動子甲基化與臨床病理關系

NSCLC組外周血Runx3基因啟動子甲基化在性別、年齡、吸煙史和病理類型方面無明顯差異(均P>0.05)，在胸腔積液、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期的差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，有胸腔積液、低分化、腫瘤最大徑≥7cm、有淋巴結轉(zhuǎn)移、有遠處轉(zhuǎn)移和Ⅲ+Ⅳ期患者Runx3基因啟動子甲基化率顯著高于無胸腔積液、高+中分化、腫瘤最大徑<7cm、無淋巴結轉(zhuǎn)移、無遠處轉(zhuǎn)移和Ⅰ+Ⅱ期患者，均P<0.05。(見表3)。

表3 NSCLC組患者Runx3基因啟動子甲基化與臨床病理因素關系

三、Runx3基因啟動子甲基化與預后關系

NSCLC組患者中Runx3基因啟動子甲基化者R0切除率、3年生存率及總生存時間均顯著低于Runx3基因啟動子未甲基化患者，均P<0.05，(見表4)。

表4 NSCLC組患者Runx3基因啟動子甲基化與未甲基化預后比較

討 論

甲基化與基因突變機制完全不同，不涉及堿基序列的突變而僅甲基基團改變，5’甲基化mCpG結構自身或結合甲基結合蛋白后可阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結合而抑制RNA轉(zhuǎn)錄，高甲基化和低甲基化異常均可導致基因表達異常，是目前發(fā)現(xiàn)的最主要的基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控機制[5]。Runx3基因為新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，主要功能為調(diào)控TGF-β信號傳導通路，具有調(diào)控細胞周期、增殖及凋亡作用，在多種腫瘤中已被證實處于高甲基化狀態(tài)[6]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關[7]。越來越多的研究證實Runx3基因啟動子甲基化在腫瘤的病情和預后評估中具有重要作用，較傳統(tǒng)的腫瘤標志物具有更高的靈敏度及特異性，相信隨著大規(guī)?；驕y序及高通量檢測基因水平的標志物更符合精準醫(yī)學的要求[8]。目前的研究證實，NSCLC切除后的腫瘤標本中可檢測到Runx3基因啟動子mRNA和蛋白質(zhì)表達水平顯著降低，進一步研究發(fā)現(xiàn)Runx3基因啟動子甲基化是其表達下降的主要機制，且與NSCLC病情嚴重程度及TNM分期緊密相關[9]。本研究中，NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動子甲基化顯著高于CON組正常健康人(P<0.05)，這些證據(jù)證實Runx3基因啟動子甲基化異常與NSCLC發(fā)病機制的相關性，可能是是NSCLC病情及預后評估的標志物。

目前研究Runx3基因啟動子與NSCLC病情及預后的關系主要為術后病理標本的檢測，無法在術前為病情及預后評估提供客觀證據(jù)，對于某些無法取得病理組織的患者不具有任何價值，這些不足限制了術后標本檢測在臨床上的廣應用[10-11]。與手術后切除標本相比，外周血具有獲取方便等優(yōu)點，尤其對于某些無法取得病理的患者更具有優(yōu)勢，但外周血可能存在陽性率不高的缺點。本研究中，NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動子甲基化在性別、年齡、吸煙史和病理類型方面無明顯差異(均P>0.05)，在胸腔積液、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期的差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，有胸腔積液、低分化、腫瘤最大徑≥7cm、有淋巴結轉(zhuǎn)移、有遠處轉(zhuǎn)移和Ⅲ+Ⅳ期患者Runx3基因啟動子甲基化率顯著高于無胸腔積液、高+中分化、腫瘤最大徑<7cm、無淋巴結轉(zhuǎn)移、無遠處轉(zhuǎn)移和Ⅰ+Ⅱ期患者(均P<0.05)。進一步研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組患者中Runx3基因啟動子甲基化者R0切除率、3年生存率及總生存時間均顯著低于Runx3基因啟動子未甲基化患者(均P<0.05)。這些證據(jù)表明Runx3基因啟動子高甲基化在NSCLC病情及預后評估具有重要價值，與傳統(tǒng)的標志物相比，外周血樣本獲取方便快捷，基因水平的標志物可能具有更高的特異性及靈敏度，相信隨著科技水平的發(fā)展，基因水平的標志物更具有優(yōu)勢。

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Detection of peripheral blood Runx3 gene promoter methylation in non-small cell lung cancer and its clinical value

CHENQing-ping,KEYao-qi

DepartmentofRespiratoryMedicine,XiangyangCentralHospital,Xiangyang,Hubei441000,China

Objective To detect the peripheral blood Runx3 gene promoter methylation in non-small cell lung cancer and its clinical value. Methods Methylation specific PCR was used to detect the Runx3 gene promoter methylation by peripheral blood in patient with non-small cell lung cancer (the NSCLC group) and normal healthy people (the control group). The Runx3 gene promoter methylation rates in different clinicopathological factors were compared. The R0 radical resection, 3-year survival rate and total survival time between patients with Runx3 gene promoter methylation and unmethylation were compared. Results The Runx3 gene promoter methylation rate in the NSCLC group was significantly higher than in the control group (P<0.05). The Runx3 gene Promoter methylation rate showed obvious difference in pleural effusion, degree of differentiation, tumor diameter, lymph node metastasis, distant metastasis and TNM staging were significant different (allP<0.05), but no difference in sex, gender, age and pathological types (allP>0.05). The R0 radical resection, 3-year survival rate and total survival time in patients with Runx3 gene promoter methylation were significantly lower than in patients with Runx3 gene promoter unmethylation (allP<0.05). Conclusion Runx3 gene promoter’s hypermethylation has value in the evaluation of non-small cell lung cancer’s disease condition and prognosis, which can be used as a bio-marker.

non-small cell lung cancer; Runx3; promoter; methylation; clinical value

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.04.008

441000 湖北 襄陽，襄陽市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科

柯耀棋，zumorf@126.com

2016-08-18]