徐建平 朱禮陽 于忠和 趙潔婷 葉偉 朱東波 孫曉 宋蓉蓉 許春偉 譚琪凡

·論 著·

非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞塊KRAS基因突變檢測分析

徐建平1朱禮陽2于忠和2趙潔婷1葉偉1朱東波1孫曉1宋蓉蓉1許春偉3譚琪凡2

目的 探討非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞塊在鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene, KRAS)突變檢測中的臨床價值。方法 采用ARMS-PCR法檢測215例非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞塊和404例非小細(xì)胞肺癌組織塊中KRAS的7種突變類型，并檢測細(xì)胞塊同時送檢組織塊74例患者的一致性。 結(jié)果 細(xì)胞塊KRAS基因突變型24例，陽性率11.16%(24/215)；組織塊KRAS基因突變型37例，陽性率9.16%(37/404)；74例有組織塊對照的細(xì)胞塊KRAS結(jié)果一致性有69例，一致率達(dá)93.24%%(69/74)，其中細(xì)胞塊KRAS基因的突變率10.81%(8/74)，組織塊突變率17.57%(13/74)。結(jié)論 非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞塊KRAS的突變率略高于組織塊；有胸水的原發(fā)灶比沒有胸水的KRAS基因突變率要高。

肺腫瘤；非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞塊；KRAS

肺癌是目前惡性腫瘤死亡的首要原因，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌病例的80%[1-4]。非小細(xì)胞肺癌中存在眾多驅(qū)動基因，其中KRAS基因是非小細(xì)胞肺癌的驅(qū)動基因之一，KRAS基因突變是EGFR-TKIs靶向治療導(dǎo)致耐藥的原因之一。KRAS基因是EGFR信號傳導(dǎo)通路中重要的下游分子，非小細(xì)胞肺癌突變率約為5%-30%[5-8]。KRAS基因突變大多發(fā)生在12、13和61位密碼子，而非小細(xì)胞肺癌中近97%KRAS基因突變涉及12或13位密碼子[9]。目前，非小細(xì)胞肺癌的靶向治療已經(jīng)進(jìn)入規(guī)范化階段。隨著靶向藥物的不斷更新，KRAS基因檢測是EGFR TKIs用藥前檢測基因之一。檢測樣本類型均在組織塊、細(xì)胞涂片、細(xì)胞蠟塊和血液樣本得到驗(yàn)證。目前，脫落細(xì)胞制成細(xì)胞塊的KRAS基因突變檢測的報道較少，本文著重探討非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞塊檢測KRAS基因突變的臨床價值。

資料與方法

一、材料

1 標(biāo)本：收集安徽省胸科醫(yī)院病理科2012年1月-2016年8月診斷為非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞塊215例和組織標(biāo)本404例。細(xì)胞塊標(biāo)本來源于胸水，組織塊標(biāo)本來源于胸膜、肺穿和手術(shù)標(biāo)本。

2 細(xì)胞塊的制備：將新鮮胸水混勻后收集50mL于離心管內(nèi)，2000r/min離心5min，棄上清液，如沉淀量不夠，可反復(fù)離心收集(血性標(biāo)本先加入3%醋酸乙醇10mL，振蕩均勻，2000r/min 5min，去除血細(xì)胞干擾)；向沉淀中加10%中性福爾馬林5mL，振蕩，2000r/min離心5min，棄上清液；向沉淀中加95%乙醇10mL，振蕩混勻，2000r/min離心10 min，棄上清液；底部沉淀鑷取到擦鏡紙上，包好，與常規(guī)組織一起行脫水處理，制成細(xì)胞石蠟塊。

3 實(shí)時熒光定量PCR檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞塊和組織中KRAS基因突變：實(shí)時熒光定量PCR 對KRAS基因突變進(jìn)行體外擴(kuò)增：顯微鏡下確認(rèn)腫瘤細(xì)胞后，取4μm厚度的細(xì)胞塊和組織塊切片4-8片，脫蠟；并按照提取基因組RNA 試劑盒(QIAamp RNA FFPE Kit，德國QIAGEN公司)說明書提供的方法提取組織DNA。應(yīng)用分光光度計(jì)檢測所提取DNA的純度和濃度,按照KRAS基因突變定性檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)說明書提供的方法，在Mx3000P實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)中進(jìn)行擴(kuò)增。該試劑盒包含KRAS基因突變類型改變(見表1)。

表1 KRAS基因突變類型

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果運(yùn)用χ2及Fisher確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，并設(shè)定P值為雙側(cè)分布，且以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。κ>0.75為一致性極好，0.4≤κ≤0.75為一致性良好，κ<0.4為一致性差。

結(jié) 果

一、細(xì)胞塊和組織塊KRAS基因突變率

215例細(xì)胞塊中，KRAS基因突變型24例，陽性率為11.16%(24/215)，其中女性15例，男性9例。404例組織塊中，KRAS基因突變型37例，陽性率為9.16%(37/404)，其中女性23例，男性14例(見表2)。

二、配對細(xì)胞塊和組織塊KRAS基因突變檢測

74例有組織塊對照的細(xì)胞塊中，KRAS基因突變型8例，陽性率為10.81%；74例組織塊中，KRAS基因突變型13例，陽性率為17.57%。兩種蠟塊檢測結(jié)果一致的有69例，其中兩者共同陽性8例，共同陰性61例，一致率為93.24%%(69/74)；未見細(xì)胞塊陽性和組織塊陰性病例，細(xì)胞塊陰性、組織塊陽性5例，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.948,P=0.000)，Kappa=0.754(見表3)。

表2 KRAS基因突變檢測結(jié)果

表3 有組織塊對照的細(xì)胞塊檢測對比結(jié)果

討 論

KRAS基因?qū)儆赗AS基因家族。RAS基因家族當(dāng)中，還有NRAS(neurolastoma-RAS)和HRAS(Harvey-RAS)[10]。KRAS基因位于第12號染色體的短臂上，KRAS蛋白有188個氨基酸，分子量為21.6kDa，在正常細(xì)胞中，細(xì)胞膜上EGFR、HER2、ErbB3、ErbB4等受體單體，在與細(xì)胞膜外的配體結(jié)合之后，就會變成二聚體。這些二聚體自身磷酸化，再磷酸化下游的信號蛋白。其中一條信號通路就是激活Grb2-Shc，再激活SOS蛋白。SOS蛋白會激活KRAS蛋白。被激活的下游信號蛋白，包括：Raf蛋白家族、PI3K、PLC-ε、RALGDS、TIAM1、RIN1這些下游蛋白。這些下游的信號通路打開之后，會進(jìn)一步激活再下游的信號通路，進(jìn)而啟動細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移等細(xì)胞功能。KRAS基因異常主要為點(diǎn)突變和基因擴(kuò)增，由于第4外顯子的拼接方式不同，更易發(fā)生突變[11]。KRAS基因點(diǎn)突變以第2號外顯子11、12、13、59和61密碼子多見，其中96%發(fā)生在第2號外顯子12、13密碼子。而KRAS基因突變后導(dǎo)致自身總處于活化狀態(tài)，因而不受EGFR上游信號的影響，這種狀態(tài)下使用EGFR靶向藥物治療無效[12]。

目前國內(nèi)外研究報道指出胸水細(xì)胞塊是檢測非小細(xì)胞肺癌中KRAS基因突變的有效途徑。2012年李梅等[13]研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞塊KRAS基因突變檢測結(jié)果與組織學(xué)一致。2014年張士偉等[14]研究表明對失去手術(shù)機(jī)會而難以獲得組織標(biāo)本的晚期非小細(xì)胞肺癌患者，可應(yīng)用ADx-ARMS方法選擇胸水細(xì)胞塊標(biāo)本篩查KRAS基因突變。本組結(jié)果顯示，細(xì)胞塊的非小細(xì)胞肺癌患者KRAS基因突變率略高于組織塊，提示具有轉(zhuǎn)移性的非小細(xì)胞肺癌患者有更高的KRAS基因突變率。在既有組織塊對照的細(xì)胞塊中， KRAS基因突變型8例，陽性率為10.81%；對應(yīng)組織塊中，KRAS基因突變型13例，陽性率為17.57%。兩種蠟塊檢測結(jié)果一致的有69例，其中兩者共同陽性8例，共同陰性61例，一致率為93.24%%(69/74)；未見細(xì)胞塊陽性和組織塊陰性病例，細(xì)胞塊陰性、組織塊陽性5例，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.948,P=0.000)，Kappa=0.754。

綜上所述，應(yīng)用細(xì)胞學(xué)標(biāo)本、細(xì)胞塊檢測KRAS基因突變，結(jié)果確實(shí)可信；細(xì)胞塊解決了脫落細(xì)胞無法保存和連續(xù)切片的問題，具有一定臨床應(yīng)用價值。

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Analysis of cell blocks KRAS mutation in pleural effusion of lung adenocarcinoma

XUJian-ping,ZHULi-yang,YUZhong-he,ZHAOJie-ting,YEWei,ZHUDong-bo,SUNXiao,SONGRong-rong,XUChun-wei,TANQi-fan

DepartmentofPathology,AnhuiChestHospital,Hefei,Anhui230032,China

Objective To investigate the clinical value of cell block for kirsten rat sarcoma viral oncogene (KRAS) mutation detection in non-small cell lung cancer(NSCLC). Methods 215 cases of cell block from pleural effusion of non-small cell lung cancer were collected. 7 types of KRAS mutation and 404 cases of tissue block were detected by ARMS-PCR method. The consistency of KRAS mutation was examined in 74 patients with tissue block and cell block. Results KRAS mutations were found in 24 of 215 cell blocks (positive detection rate of 11.16%). KRAS mutation was detected in 37 of 404 tissue blocks (positive detection rate of 9.16%). There were 69 cases in the 74 (93.24%) cases having the same result as tissue block. KRAS mutation was detected in 8 of 74 (10.81%) cell blocks, and 13 of 74 (17.57%) tissue blocks. Conclusion The rate of KRAS mutation in cell blocks of non-small cell lung cancer is higher than in matched tissue blocks. The patients with malignant pleural effusion are likely tend to KRAS mutation compare to those not.

lung neoplasm; adenocarcinoma; cell block; KRAS

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.04.001

國家自然科學(xué)基金(No 81372489)；北京市科技計(jì)劃課題(No 2131100006813032)；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)新科研基金項(xiàng)目(No ZH-2014-10)

1. 230032 安徽 合肥，安徽省胸科醫(yī)院病理科 2. 100700 北京，陸軍總醫(yī)院腫瘤科 3. 100071 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院病理科

于忠和，E-mail: 773080192@qq.com

2016-09-12]