劉文宣，楊 磊，劉文聰，姚智燕，李 濤，蘇 鵬

(1.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院超聲科，河北 石家莊 050031；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；4.遼寧省遼陽市中心醫(yī)院胸外科，遼寧 遼陽 111000)

·論 著·

降鈣素基因相關(guān)肽參與調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞分化

劉文宣1，楊 磊1，劉文聰2，姚智燕3，李 濤1，蘇 鵬4*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院超聲科，河北 石家莊 050031；3.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；4.遼寧省遼陽市中心醫(yī)院胸外科，遼寧 遼陽 111000)

目的研究降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)對(duì)人外周血中Th17(IL-17 producing T cell)和Treg(regulatory T cell)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。方法采用免疫磁珠法(magnetic activated cell sorting，MACS)分離人外周血中CD4+CD45RA+T細(xì)胞，即初始CD4+T細(xì)胞，在一定條件下分別體外誘導(dǎo)其向Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化，之后用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Th17和Treg細(xì)胞所占比例；用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(orphan nuclear receptor γt，RORγt)和轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 (foxhead box protein 3)mRNA的表達(dá)水平；用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)Th17細(xì)胞上清中IL-17A的含量，進(jìn)而從多個(gè)方面探討CGRP對(duì)Th17和Treg細(xì)胞分化的影響。結(jié)果CGRP可劑量依賴性增加Th17細(xì)胞所占的比例和RORγt mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)；另外，CGRP也促進(jìn)了IL-17A的分泌(P<0.05)。同時(shí)，CGRP能劑量依賴性抑制Treg細(xì)胞所占的比例和FoxP3 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論CGRP可促進(jìn)人外周血中初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，而抑制其向Treg細(xì)胞分化。

降鈣素；Th17細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性

Th17(IL-17 producing T cell)細(xì)胞表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(orphan nuclear receptor γt，RORγt)因其可分泌白細(xì)胞介素(interleukin，IL)17而命名，該細(xì)胞通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，參與多種自身免疫性疾病的免疫應(yīng)答[1]。Treg細(xì)胞(regulatory T cell)雙表達(dá)CD25和轉(zhuǎn)錄因子FoxP3(foxhead box protein 3)，主要作用表現(xiàn)為抑制抗原呈遞細(xì)胞的功能、抑制T細(xì)胞增殖及促炎性細(xì)胞因子分泌[2]?？梢姡琓h17和Treg細(xì)胞在功能上表現(xiàn)出互相抑制的特點(diǎn)，分化發(fā)育方面亦是如此。但研究表明，二者的分化平衡在多種疾病，如自身免疫性疾病及炎癥性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3]。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)是Rosenfeld等1983年在神經(jīng)組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種由37個(gè)氨基酸殘基組成的多功能生物活性多肽，廣泛分布于機(jī)體中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)以及淋巴器官的神經(jīng)末梢中，對(duì)機(jī)體多個(gè)臟器和系統(tǒng)的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，如CGRP作為一種免疫調(diào)節(jié)肽，在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。最近的研究結(jié)果顯示，CGRP通過抑制抗原提呈細(xì)胞的功能進(jìn)而抑制Th1細(xì)胞分化及γ干擾素分泌，同時(shí)促進(jìn)Th2細(xì)胞分化及IL-4分泌[4-5]。為了對(duì)CGRP的免疫調(diào)節(jié)功能有更全面的了解，本研究擬探索CGRP對(duì)Th17和Treg細(xì)胞分化是否具有調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 LEAFTM-purified anti-human CD3(OKT3)和LEAFTM-purified anti-human CD28(CD28.2)購于Biolegend(San Diego，CA)公司；人重組TGF- β1、人重組IL-2、人重組IL-6、人重組IL-1 β和人重組IL-23購于 R&D(Lille，F(xiàn)rance)公司；CGRP購于Cayman Chemical(Ann Arbor，MI)公司；PCR引物購于上海生工生物科技公司；反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit)購于TaKaLa公司；FITC anti-human CD4、FITC anti-human CD25(2A3)、PE anti-human FoxP3(259D/C7)、PE anti-human IL-17A(N49-653)等抗體及流式細(xì)胞檢測(cè)所需細(xì)胞破膜劑、固定劑等試劑均購于 BD(San Diego，CA)公司。

1.2 細(xì)胞的制備 Ficoll密度梯度離心法制備外周血單個(gè)核細(xì)胞，使用CD4+CD45RA+磁珠分離試劑盒分選初始 CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定純度>95%。

1.3 T細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化方案 收集分選初始 CD4+T細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%熱滅活胎牛血清，青霉素/鏈霉素100 U/ mL)重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種于用anti-CD3抗體(濃度為5 mg/L)預(yù)先包被的24孔U形板中，之后使用不同方法誘導(dǎo)培養(yǎng)Th17和Treg細(xì)胞：加入CD28抗體(終濃度為2 mg/L)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(終濃度為5 μg/L)、IL-6(終濃度為20 μg/L)、IL-1β(終濃度為20 mg/L)及IL-23(終濃度為25 μg/L)刺激培養(yǎng)Th17細(xì)胞；加入CD28抗體(終濃度為2 mg/L)、TGF-β1(終濃度為5 μg/L)、IL-2(終濃度為500 U/mL)刺激培養(yǎng)Treg細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)7 d。以上述誘導(dǎo)方案培養(yǎng)的細(xì)胞為單純誘導(dǎo)組，即對(duì)照組；以在單純誘導(dǎo)方案的基礎(chǔ)上加入不同濃度CGRP(終濃度分別為10-9、10-8、10-7、10-6mol)的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，通過比較檢測(cè)不同濃度的CGRP對(duì)Th17和Treg細(xì)胞分化是否具有調(diào)節(jié)作用。

1.4 胞內(nèi)染色和流式檢測(cè)方法 Th17細(xì)胞的胞內(nèi)染色方法：磁珠分選的初始 CD4+T細(xì)胞，采用上述分組方式，按照上述Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法培養(yǎng)細(xì)胞，7 d后收集各組細(xì)胞，加入CD4抗體37℃避光孵育30 min，之后加入佛波酯(PMA，終濃度為50 μg/L)、離子霉素 (ionomycin，終濃度為1 μmol)和0.7 μL蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(BD GolgistopTM)繼續(xù)37 ℃避光孵育4 h。使用固定劑、破膜劑處理細(xì)胞之后，加入IL-17A抗體室溫避光孵育45 min。最后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞中CD4+IL-17+T細(xì)胞，即Th17細(xì)胞所占比例。Treg細(xì)胞的胞內(nèi)染色方法：磁珠分選的初始 CD4+T細(xì)胞，采用上述分組方式，按照上述Treg細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法培養(yǎng)細(xì)胞，7 d后收集各組細(xì)胞，加入CD25抗體室溫避光孵育30 min，用固定劑、破膜劑處理細(xì)胞之后，加入FoxP3抗體并室溫避光孵育45 min。最后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)各組細(xì)胞中CD25+FoxP3+T細(xì)胞，即Treg細(xì)胞所占比例。

1.5 RNA提取和實(shí)時(shí)定量RT-PCR 磁珠分選的初始 CD4+T細(xì)胞，采用上述分組方式，按照上述Th17和Treg細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法培養(yǎng)細(xì)胞，7 d后收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞的全基因組RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取2 μL cDNA為模板，使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，引物序列如下。RORγt F:5′-CTCAAAGCAGGAGCAA-TGGAAGT-3′,RORγt R:5′-GGAGTGGGAGAA-GTCAAAGATGGA-3′； FoxP3 F:5′-CATCCGCC-ACAACCTGAGTCTGC-3′,FoxP3 R:5′-CCTG-TTCGTCCATCCTCCTTTCCT-3′;β-actin F:5′-GTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3′,β-actin R:5′-CTTAGTTGCG -TTACACCCTTTCTT-3′。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞中RORγt mRNA和 FoxP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果以待測(cè)基因/β-actin的Ct比值表示。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)IL-17A水平 磁珠分選的初始 CD4+T細(xì)胞，采用上述分組方式，按照上述Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法培養(yǎng)細(xì)胞，7 d后收集各組細(xì)胞上清，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法試劑盒檢測(cè)上清液中IL-17A蛋白水平，具體操作參照試劑說明書。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料比較分別采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 誘導(dǎo)前后Th17和Treg細(xì)胞比較 誘導(dǎo)分化后細(xì)胞中含Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞較誘導(dǎo)分化前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2 不同時(shí)點(diǎn)間RORγt和FoxP3的表達(dá) 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，RORγt和FoxP3 mRNA的表達(dá)逐漸升高，在第7天時(shí)表達(dá)量達(dá)高峰，誘導(dǎo)后第3天、第5天、第7天與誘導(dǎo)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表1 誘導(dǎo)初始CD4+T 細(xì)胞向Th17和Treg細(xì)胞分化

檢測(cè)時(shí)間Th17細(xì)胞Treg細(xì)胞誘導(dǎo)分化前0.24±0.051.14±0.26誘導(dǎo)分化后5.76±0.1928.86±3.21t48.66214.911P0.0000.000

表2 RORγt和FoxP3 mRNA表達(dá)具時(shí)間依從性

檢測(cè)時(shí)間RORγtmRNAFoxP3mRNA誘導(dǎo)前1.00±0.001.00±0.00第1天2.19±0.360.82±0.08第3天3.63±0.49*6.49±1.10*第5天7.68±0.91*11.77±1.08*第7天12.95±1.31*15.84±1.16*F122.203170.951P0.000.00

*P<0.05與誘導(dǎo)前比較(SNK-q檢驗(yàn))

2.3 不同濃度CGRP對(duì)Th17細(xì)胞、RORγt mRNA和IL-17A的影響 誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后結(jié)果顯示，隨著CGRP濃度的增加，Th17細(xì)胞、RORγt RNA和IL-17A均呈逐漸升高，Th17細(xì)胞在CGRP10-7mol和CGRP-6mol、RORγt mRNA和IL-17A在CGRP10-8mol、CGRP-7mol、CGRP-6mol時(shí)內(nèi)表達(dá)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

2.4 不同濃度CGRP對(duì)Treg細(xì)胞和FoxP3的影響 隨著CGRP濃度的增加，Treg細(xì)胞和FoxP3 mRNA的表達(dá)逐漸降低，在CGRP10-8mol、CGRP-7mol和CGRP10-6mol濃度時(shí)的表達(dá)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表3 CGRP對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響

組別 Th17細(xì)胞(%)RORγtmRNA(fold)IL-17A(ng/L)對(duì)照組 5.76±0.191.00±0.00125.55±7.63CGRP(10-9mol)6.65±0.321.09±0.08159.45±8.12CGRP(10-8mol)7.96±0.391.30±0.03*188.17±10.12*CGRP(10-7mol)8.46±0.48*1.46±0.05*209.91±11.55*CGRP(10-6mol)9.54±0.89*1.54±0.07*246.45±15.10*F 25.40254.45154.782P 0.0000.0000.000

*P<0.05與對(duì)照組比較(SNK-q檢驗(yàn))

表4 CGRP對(duì)Treg細(xì)胞分化的影響

組別 Treg細(xì)胞(%)FoxP3mRNA(fold)對(duì)照組 28.86±3.211.00±0.00CGRP(10-9mol)22.31±5.150.91±0.04CGRP(10-8mol)15.83±6.74*0.74±0.08*CGRP(10-7mol)13.75±5.93*0.56±0.09*CGRP(10-6mol)11.19±4.78*0.28±0.06*F 5.48262.820P 0.010<0.05

*P<0.05與對(duì)照組比較(SNK-q檢驗(yàn))

3 討 論

Th17 和 Treg細(xì)胞的分化平衡在自身免疫性疾病及炎癥相關(guān)疾病，如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。Th17 和 Treg細(xì)胞都是由Th0細(xì)胞分化而來的，Th17 細(xì)胞具有明顯的促炎作用，而 Treg細(xì)胞具抗炎性能，二者在功能上互相拮抗，在分化過程上互相抑制，但有一定的相關(guān)性：當(dāng)機(jī)體處在穩(wěn)定狀態(tài)下，抗原提呈細(xì)胞分泌的TGF-β促進(jìn)Th0向Treg細(xì)胞分化，同時(shí)IL-2的存在可促進(jìn)Treg細(xì)胞的進(jìn)一步增殖；而機(jī)體在感染或炎癥狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)大量分泌IL-6和IL-1β，二者與抗原提呈細(xì)胞分泌的TGF-β一起共同誘導(dǎo)Th0向Th17細(xì)胞分化，同時(shí)IL-23的存在可促進(jìn)Th17細(xì)胞的進(jìn)一步增殖。本研究應(yīng)用免疫磁珠法分選初始 CD4+T細(xì)胞，使用anti-CD3、anti-CD28抗體、TGF-β1、IL-6、IL-1β及IL-23培養(yǎng)7 d, 成功誘導(dǎo)了Th17細(xì)胞的分化；使用anti-CD3、anti-CD28抗體、TGF-β1及IL-2培養(yǎng)7 d, 成功誘導(dǎo)了Treg細(xì)胞的分化。此方法與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7-8]。同時(shí)還研究了在誘導(dǎo)過程中，Th17和Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和FoxP3 在mRNA水平的表達(dá)情況，結(jié)果表明RORγt mRNA和FoxP3 mRNA的表達(dá)量均隨誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)量逐漸增加，在7 d時(shí)表達(dá)量達(dá)高峰。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7-8]。Th17和Treg細(xì)胞誘導(dǎo)模式的成功為本研究提供了基礎(chǔ)平臺(tái)。

CGRP作為免疫調(diào)節(jié)肽，具有多種免疫調(diào)節(jié)作用。如CGRP可以抑制T細(xì)胞增殖、存活及IL-2的分泌[9]；CGRP可抑制脂多糖誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞分泌TNF-ɑ、 IL-12等促炎性細(xì)胞因子[4]；CGRP可抑制樹突細(xì)胞成熟、抑制樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移、抗原呈遞及其活化T細(xì)胞的功能[10]，并通過抑制樹突狀細(xì)胞的功能進(jìn)而抑制Th1細(xì)胞分化及INF-γ分泌，而促進(jìn)Th2細(xì)胞分化及IL-4分泌[4-5]；另外，CGRP還可促進(jìn)Th9細(xì)胞分化及IL-9分泌[11]?？梢姡珻GRP作為一種重要的調(diào)節(jié)介質(zhì)參與了T細(xì)胞分化。本研究結(jié)果顯示，CGRP增加了人外周血CD4+T細(xì)胞中RORγt mRNA的表達(dá)及Th17細(xì)胞所占的比例，可見CGRP可促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。另外，本研究又測(cè)定了各組Th17細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-17A含量，結(jié)果表明CGRP也顯著促進(jìn)了IL-17A分泌。說明CGRP不僅促進(jìn)了Th17細(xì)胞的分化，其對(duì)Th17細(xì)胞的功能也具有調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，CGRP下調(diào)了人外周血來源的CD4+T細(xì)胞中FoxP3 mRNA的表達(dá)及Treg細(xì)胞所占的比例，也就是說，CGRP可抑制初始CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化。CGRP可與一些炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞等相互作用，參與調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)。有研究表明，在體內(nèi)，CGRP通過調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞的功能參與接觸性皮炎[5]、卵白蛋白誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)[12]、過敏性支氣管哮喘[13]等一系列免疫性炎癥過程；CGRP還可通過影響免疫細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α和 IL-6，而在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[14]。令我們感興趣的是，最近有研究發(fā)現(xiàn)CGRP可以通過調(diào)節(jié)IL-17的表達(dá)而促進(jìn)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)生[15]?？磥?，CGRP作為免疫調(diào)節(jié)肽，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，CGRP對(duì)人外周血中Th17和Treg細(xì)胞分化均有調(diào)節(jié)作用，接下來的研究中，將建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型，進(jìn)一步確定CGRP是否可以通過調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞分化平衡參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，從而為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。

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(本文編輯：劉斯靜)

Calcitonin gene related peptide participate in the regulation of Th17 and Treg differentiation

LIU Wen-xuan1, YANG Lei1, LIU Wen-cong2, YAO Zhi-yan3, LI Tao1, SU Peng4*

(1.DepartmentofEpidemiologyandStatistics,SchoolofPublicHealth，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China；2.DepartmentofUlstrasound,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China；3.DepartmentofImmunology,InstituteofBasicMedicine,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China; 4.DepartmentofThoracicSurgery,theCentralHospitalofLiaoyangCity,Liaoyang111000,China)

Objective To dissect the role of calcitonin gene related peptide(CGRP) on IL-17 producing T cell(Th17) and regulatory T cell(Treg) differentiation. Methods Naive CD4+T cells were isolated from human peripheral blood by magnetic activated cell sorting(MACS) selection, and cultured under Th17-polarizing and Treg-polarizing condition, The proportion of Th17 cells and Treg cells were detected by flow cytometry, the relative expression levels of retionid-related orphan nuclear receptor γt(RORγt) mRNA and foxhead box protein 3(FoxP3) mRNA were measured by real-time RT-PCR. In addition, we detected the production of IL-17A by enzyme-linked immunosorbent assay, we explored the effects of CGRP on the differentiation of Th17 and Treg cells form Several aspects. Results CGRP increased the proportion of Th17 cells and the expression of RORγt mRNA(P<0.05). Additionally, CGRP also increased the production of IL-17A(P<0.05), these effects of CGRP were in dose-dependent manner. Meanwhile, CGRP inhibited the percentage of Treg cells and the expression of FoxP3 mRNA also in dose-dependent way(P<0.05), peaking at 10-6M. Conclusion These results demonstrate that CGRP facilitates naive CD4+T cells from human peripheral blood differentiate to Th17 cells, but suppresses them differentiate to Treg cells.

calcitonin; Th17 cells ；T-lymphocytes, regulatory

2016-11-18；

2017-01-04

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究計(jì)劃(QN2015006)；河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20150626，20150631)

劉文宣(1983-)，女，河北欒城人，河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院副教授，醫(yī)學(xué)博士,從事類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫機(jī)制研究。

*通訊作者。E-mail:76654228@qq.com

R392.9

A

1007-3205(2017)03-0326-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.019